الحصاد ، وإزالة الخلايا ، وهضم البيبسين لأنسجة الرئة البقرية لتشكيل هيدروجيل مصفوفة الرئة خارج الخلية

1 للبدء ، قم بإزالة أنسجة الرئة البقرية المجمدة2 من 80 درجة مئوية 3 واتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة. 4 قم بتشريح الأنسجة باستخدام مشارط ومقصات معقمة 5 لإزالة القصبة الهوائية والممرات الهوائية الغضروفية ، 6 ثم نعناع الأنسجة إلى قطع صغيرة. 7 اغسل المنديل ثلاث مرات 8 بالماء عالي النقاء 9 يحتوي على 2٪ بنسلين وستربتومايسين.

10 اغمر عينة الأنسجة المفرومة 11 في محلول اليود 2٪ لمدة دقيقة واحدة ، 12 ثم قم بغسلتين متتاليتين 13 في ماء مقطر معقم. 14 انقل قطع المناديل إلى أنبوب سعة 50 مليلتر 15 حتى علامة 15 ملليلترا. 16 املأ الأنبوب إلى الأعلى بالماء المقطر 17 وقم بتجميده في النيتروجين السائل لمدة دقيقتين.

18 ثم انقل الأنبوب على الفور إلى دورق 19 يحتوي على 37 درجة مئوية ماء لمدة 10 دقائق. 20 بعد خمس دورات ذوبان الجليد ، 21 احتضان العينة في 30 مل 22 من محلول DNase لمدة ساعة واحدة 23 عند 37 درجة مئوية مع التحريك المستمر. 24 قم بتجميد عينات المصفوفة خارج الخلية الرطبة منزوعة الخلايا 25 عند 80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

26 انقل العينات المجمدة إلى مجفف 27 وتعمل في وضع التجفيف تحت فراغ 28 لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تجف بالكامل. 29 بعد التجفيف بالتجميد ، قم 30 بطحن العينات إلى مسحوق ناعم 31 في جهاز طحن يحتوي على ثلج جاف. 32 عالج أنسجة الرئة بنسبة 1٪ Triton-X-100 33 لمدة ثلاثة أيام تحت دوران لطيف 34 عند أربع درجات مئوية ، 35 تغيير المحلول كل 24 ساعة.

36 احتضان العينة في محلول DNase 37 لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية مع التحريك المستمر. 38 اغسل الأنسجة بالماء المقطر 39 لمدة ثلاثة أيام تحت الدرفلة المستمرة ، 40 تجديد الماء كل 24 ساعة. 41 بعد الغسيل الأخير ، قم بإجراء التجميد والطحن بالتبريد 42 كما هو موضح سابقا.

43 هضم 15 ملليغرام لكل مليلتر 44 عينات مصفوفة خارج الخلية مسحوقة منزوعة الخلايا 45 في ملليغرام واحد لكل مليلتر محلول بيبسين 46 في درجة حرارة الغرفة تحت التحريك المستمر لمدة 48 ساعة. 47 حافظ على درجة حموضة المحلول عند اثنين من أجل الهضم الفعال. 48 الطرد المركزي هضم الأنسجة عند 5 ، 000 جم لمدة 10 دقائق 49 وإزالة المادة الطافية.