للبدء ، قم بإعداد ملليغرام واحد لكل ملليلتر من محلول الكولاجين الوريدي في الماء وأضف 95 ميكرولترا من هذا المحلول إلى كل بئر من شريحة الغرفة السفلية للتصوير المكونة من 10 آبار. احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين لتغطية الآبار. من العضويات المعوية البشرية 3D المستزرعة ، قم بإزالة وسيط صيانة WRNE من الآبار بعد خمسة إلى سبعة أيام من الممر الأخير.
ثم أضف 500 ميكرولتر من 1xPBS تحتوي على 0.5 مللي مولار EDTA لكل بئر. باستخدام طرف ملليلتر واحد مشفر مسبقا ، ماصة بلطف لفصل BMM عن اللوحة. انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مشفر مسبقا.
شطف كل بئر مع 500 ميكرولتر إضافية من محلول PBS EDTA. أجهزة الطرد المركزي التعليق وإزالة BMM الطافية والمتبقية. بعد ذلك ، استخدم طرفا مشفرا مسبقا لإعادة تعليق الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من PBS تحتوي على خمسة ملليمولار EDTA.
أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وإعادة تعليقها في ملليلتر من العازلة التفكك الأنزيمي. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم أضيفي ثلاثة ملليلتر من CMGF- مع 10٪ FBS ، واخلطيهم برفق.
أجهزة الطرد المركزي وإضافة ملليلتر واحد من CMGF إلى بيليه. ماصة بقوة الخليط 80 إلى 100 مرة لكسر المواد العضوية إلى خلايا واحدة. أجهزة الطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط WRNE.
احصل على عدد الخلايا وخفف معلق الخلية لتحقيق 1.25 في 10 أس الخلايا الخمس في 100 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الكولاجين من اللوحة المعدة مسبقا ، وتجنب لمس قاع البئر. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الخلية المحضر لكل بئر.
احتضان لمدة 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية. استبدل الوسط ب 100 ملليلتر من وسط التمايز لكل بئر بعد كل 24 ساعة حتى التقاء. بعد هذه النقطة ، تكون الطبقات الأحادية جاهزة للتطبيقات النهائية.
