للبدء ، قم بإعداد مجهر التألق. قبل التصوير ، سخن حاضنة Stage Top إلى 37 درجة مئوية وقم بتشغيل ثاني أكسيد الكربون المرطب في الغرفة بمعدل 0.02 لتر في الدقيقة. ثم ضع الشريحة ذات الطبقات الأحادية المصابة في غرفة الحاضنة وأغلق الغطاء.
باستخدام هدف 20X تحت إضاءة المجال الساطع ، حدد إحداثيات X و Y لمجالات الرؤية داخل الطبقة الأحادية. تحسين معلمات التصوير والحصول على صورة باستخدام طول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر. لتقليل السمية الضوئية ، اضبط مصدر الضوء على 50٪ من الطاقة مع وقت تعرض يبلغ 50 مللي ثانية.
تأكد من عدم تشبع وحدات البكسل واضبطها لاكتشاف النطاق الديناميكي الكامل لمستشعر الكالسيوم الفلوري. قم بإعداد حلقة تصوير واحصل على صورة في كل إحداثيات X و Y محددة في حلقة مدتها دقيقة واحدة ، وقم بالصورة في هذه الحلقة باستمرار. بالنسبة للفيروسات ذات العلامات الفلورية ، احصل على صورة على القناة المناسبة كل حلقة 10.
في حالة استخدام فيروسات غير فلورية ، قم بإجراء تلطيخ الفلورسنت الأميني بعد التصوير. أولا ، قم بإصلاح الطبقات الأحادية ب 100 ميكرولتر من الفورمالديهايد. بعد الحضانة ، قم بإزالة المثبت وإخماده ب 100 ميكرولتر من كلوريد الأمونيوم 50 مللي مولار لمدة 10 دقائق.
بعد إزالة كلوريد الأمونيوم ، قم بنفاذ الطبقات الأحادية ب 100 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X-100 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة المحلول ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول الحجب ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة. ثم قم بإزالة محلول الحظر وإضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخدوعة في 1X PBS.
احتضان طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف. بعد الحضانة ، قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية واغسلها ثلاث مرات باستخدام 1X PBS. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة الفلورية المخدوعة في 1X PBS.
لمنع التبييض الضوئي ، احم اللوحة من الضوء واحتضانها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. إزالة الأجسام المضادة الثانوية بعد الحضانة وصمة عار العينات بمحلول DAPI. ثم ضع الطبقات الأحادية الثابتة في 100 ميكرولتر من 1X PBS للتصوير.
ضع الشريحة مرة أخرى على مرحلة المجهر. أعد تحميل إحداثيات X و Y من تشغيل التصوير المباشر وقم بتصوير كل نقطة متعددة على القناة المقابلة للجسم المضاد الثانوي المستخدم للتلطيخ. قم بالرجوع إلى الصور من تشغيل التصوير المباشر لضمان التقاط نفس النقاط.
باستخدام هذه التقنية ، تم تصوير عدوى فيروس الروتا في طبقة أحادية hIO بعد تسجيل هذه الطبقة الأحادية. بالنسبة للسلالات المؤتلفة من فيروس الروتا التي تعبر عن البروتينات الفلورية ، مثل mRuby ، تم التحقق من العدوى أثناء التصوير الحي. بينما عند استخدام سلالة لا تعبر عن علامة ، تم الكشف عن العدوى عن طريق التألق المناعي بعد التصوير.
