للبدء ، قم بإعداد محلول المخزن المؤقت الخارجي GUV في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. يخلط معا السبيرميدين ، ATP ، GTP ، CTP ، UTP ، فوسفات الكرياتين ، أسيتات المغنيسيوم ، غلوتامات البوتاسيوم ، HEPES ، هيدروكسيد البوتاسيوم ، حمض الفولينيك. الجلوكوز ، ومخزون الأحماض الأمينية.
أضف ماء منزوع الأيونات فائق النقاء ليصل الحجم النهائي للمحلول إلى ملليلتر واحد. بعد ذلك ، في غطاء الدخان ، أضف 17.3 ميكرولتر من محلول مخزون POPC إلى قارورة زجاجية سعة 15 ملليلتر. لهذا ، ماصة 1.08 ميكرولتر من البوليمر المشترك PEO-b-PBD.
قم بنفخ تيار لطيف من غاز الأرجون بعناية في القارورة الزجاجية أثناء تدوير القارورة لتبخير الكلوروفورم. ثم ماصة 1.2 ملليلتر من الزيت المعدني الخفيف في القارورة الزجاجية. دوامة الدهون والزيت بأقصى سرعة لمدة 10 إلى 20 ثانية.
ضع القارورة الزجاجية في الفرن على حرارة حوالي 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل الدوامة لمدة 10 إلى 20 ثانية إضافية بأقصى سرعة. بعد ذلك ، ماصة 270 ميكرولتر من الحل الخارجي GUV في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. لهذا ، ماصة 15 ميكرولتر لكل من خمسة مولار كلوريد الصوديوم و 4.5 مولار كلوريد البوتاسيوم.
ماصة بلطف 300 ميكرولتر من خليط الدهون والزيت فوق محلول GUV الخارجي. بعد الحضانة ، قم بتجميع تفاعل CFE عن طريق سحب المحاليل من 1 إلى 3 ، وترميز بلازميد الحمض النووي ل sfGFP القابل للذوبان أو متغيرات مستقبلات الغلوتامات sfGFP ، و RNAse الفئران ، والسكروز المولي في قنينة. أضف ماء منزوع الأيونات عالي النقاء ليصل حجم التفاعل إلى 20 ميكرولتر.
أضف 600 ميكرولتر من خليط الزيت الدهني إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على خليط تفاعل 20 ميكرولتر. ماصة صعودا وهبوطا بقوة لمدة دقيقة واحدة لاستحلاب رد الفعل. ضع المستحلب الداخلي برفق فوق طبقة الزيت في الأنبوب.
أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 2000 غرام عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بسحب الزيت الزائد والمحلول الخارجي بعناية من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. امزج حبيبات GUV برفق في المحلول المتبقي لإعادة تعليقها.
انقل محلول GUV إلى صفيحة سفلية مسطحة نظيفة ب 96 بئرا للحضانة. انقل اللوحة المختومة إلى قارئ لوحة لاحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى ست ساعات. بعد الحضانة ، ضع اللوحة على مجهر متحد البؤر مقلوب.
ركز على منطقة الاهتمام التي تحتوي على GUVs ، ثم التقط الصور بطول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر. احفظ الصور بتنسيق TIFF. افتح الصور في برنامج معالجة الصور.
انقر فوق لوحة إعداد السطوع / التباين لفتحها. ثم اضبط السطوع والتباين لجعل البروتينات الفلورية مرئية. أظهرت تفاعلات التعبير الخالية من الخلايا لمستقبلات الغلوتامات من النوع البري المغلفة في GUV تعبيرا ممتازا وتوطينا غشائيا.
وكانت مستقبلات ورقات استراتيجية الحد من الفقر - الغلوتامات عرضة للتجميع وتكوين الثقب. تم التعبير عن sfGFP القابل للذوبان في GUVS وبقي في تجويف GUV.
