التنقية الجينومية وإعداد المكتبة للحمض النووي الأروماتي العضلي للفأر الموسوم للتنميط اللاجيني

للبدء ، أضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعلامات إلى أنابيب العينة التي تحتوي على عينات الأرومة العضلية للفأر الموسومة. ماصة EDTA ، SDS ، و proteinase K في كل أنبوب. دوامة محتويات الأنابيب لخلط جيدا ، ثم احتضان الأنابيب عند 55 درجة مئوية لمدة ساعتين في جهاز PCR.

بعد ذلك ، ماصة كل عينة في أنابيب طرد مركزي 1.5 ملليلتر تحتوي على 200 ميكرولتر من خليط الفينول والكلوروفورم. دوامة محتويات الأنابيب لخلطها. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، انقل الطبقة العليا إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر.

ثم أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الأنابيب الجديدة قبل الدوامة والطرد المركزي مرة أخرى. نضح الطبقة العليا في أنبوب جديد. أضف الآن 550 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 100٪ في كل أنبوب عينة واخلطه جيدا عن طريق التقليب.

ثم ضع الأنابيب عند درجة حرارة 80 درجة سلزية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة لتحفيز ترسيب الحمض النووي. أجهزة الطرد المركزي الحل بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة للحصول على حبيبات الحمض النووي. بعد سكب المادة الطافية ، اغسل الحبيبات بنسبة 75٪ إيثانول قبل الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق.

ثم أعد تعليق الحبيبات في 21 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. قم بإعداد PCR لاستخدامه في إعداد المكتبة. استخدم برايمر N7XX Illumina مختلفا لكل عينة وبرايمر N5XX عالمي.

أدخل رقم دورة PCR في الجهاز لتشغيل PCR. بعد التضخيم ، الكهربائي ثلاثة ميكرولتر من المكتبات على المواد الهلامية أغاروز. احتوت مكتبات CUT&Tag في الغالب على أحاديات النوكليوسومات الموسومة لحوالي 300 زوج من القواعد.

أظهر qPCR أن علامة H3K4me1 كانت غنية للغاية في المناطق المحسنة لجين MYOD1.