تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDA16020400 إلى PH) ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32170804 إلى PH).

تنميط علامات الهستون الجينومية في الأرومات العضلية للفأر باستخدام CUT &#38; Tag

<ol>
	<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+generating+high-resolution+maps+of+genome-wide+protein+binding.">A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding.</a> eLife. 4, e09225 (2015).</li><li>Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+micrococcal+nuclease+and+exonuclease+III+digestion+reveals+precise+positions+of+the+nucleosome+core/linker+junctions:+implications+for+high-resolution+nucleosome+mapping.">Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping.</a> J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).</li><li>Policastro, R. A., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+methods+for+genome-wide+profiling+of+protein+binding+sites.">Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites.</a> Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, e21856 (2017).</li><li>Mezger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+accessibility+profiling+at+single-cell+resolution.">High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution.</a> Nat Commun. 9, 3647 (2018).</li><li>Zheng, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells.">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nat Commun. 8, 14049 (2017).</li><li>Nakka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JMJD3+activated+hyaluronan+synthesis+drives+muscle+regeneration+in+an+inflammatory+environment.">JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment.</a> Science. 377 (6606), 666-669 (2022).</li><li>Fu, X., Wang, H., Hu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+activation+in+skeletal+muscle+regeneration.">Stem cell activation in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skelet Muscle. 6, 35 (2016).</li><li>Giordani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+single-cell+cartography+reveals+novel+skeletal+muscle-resident+cell+populations.">High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations.</a> Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+inflammation-related+cytokines+promotes+long-term+muscle+stem+cell+expansion.">Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion.</a> Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+transcription+factor+profiling+in+rare+stem+cell+populations+using+CUT&amp;Tag.">Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&amp;Tag.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100751 (2021).</li><li>Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD:+a+regulatory+gene+of+skeletal+myogenesis.">MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).</li><li>Wardle, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+control:+transcriptional+regulation+of+mammalian+Myod.">Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod.</a> J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).</li><li>Local, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+H3K4me1-associated+proteins+at+mammalian+enhancers.">Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers.</a> Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Faralli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UTX+demethylase+activity+is+required+for+satellite+cell-mediated+muscle+regeneration.">UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).</li><li>Yang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+transcriptional+activation+of+MyoD+mediated+by+replication-independent+histone+deposition.">Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).</li><li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT&amp;Tag.">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&amp;Tag.</a> Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يعتمد رقم الخلية المحدد المطلوب في تفاعل CUT&Tag معين تماما على إثراء علامات / متغيرات الهستون أو البروتينات المرتبطة بالكروماتين التي سيتم اختبارها. عادة بالنسبة لعلامات الهستون المخصبة جدا مثل H3K4me1 و H3K4me3 و H3K27ac وما إلى ذلك ، فإن 25000-50000 عضلي كافية تماما لتفاعل CUT&Tag واحد. ومع ذلك ، قد تتطلب بعض ...

تم اختراع اختبار CUT &Tag للتعويض عن بعض العيوب العلنية في ChIPs1. عيبان رئيسيان ل ChIPs هما 1) التحيز الذي تم تقديمه عند تجزئة الكروماتين و 2) عدم الكفاءة للعمل مع أرقام الخلايا المنخفضة. تعتمد مقايسات X-ChIP إما على صوتنة أو هضم MNase للحصول على شظايا الكروماتين ، بينما يستخدم N-ChIP في الغالب هضم MNase للحصول على النيوكليوسومات. يظهر Sonication تحيزا نحو مواقع الكروماتين المسترخية مثل مناطق المروج2 ، وعلى ما يبدو ، يعمل هضم MNase أيضا بشكل أكثر كفاءة على ألياف الكروماتين المريحة. علاوة على ذلك ، أفاد البعض أن هضم MNase يظهر أيضا تحيزا يعتمد على تسلسل الحمض النووي3. لذلك ، في خطوة إعداد المدخلات لمقايسات ChIP ، من المستحيل الحصول على شظايا الكروماتين من جميع أنواع المواقع الجينومية بطريقة عشوائية تماما. علاوة على ذلك ، عادة ما تولد مقايسات ChIP إشارات خلفية أعلى مقارنة ب CUT &Tag وتتطلب قراءات أكثر من 10 أضعاف من CUT &Tag لإبراز مكان القمم1،4،5. وهذا يفسر لماذا يجب أن تبدأ تجارب ChIP بخلايا أكثر بكثير من CUT&Tag. هذه ليست مشكلة عند دراسة خطوط الخلايا حيث يمكن تمريرها بشكل متكرر لتحقيق عدد خلايا مرتفع جدا. ومع ذلك ، فإن اختبار ChIP ليس بالتأكيد أداة جينية قوية لدراسة مجموعات الخلايا الأولية النادرة أو الثمينة ، على الرغم من أن الخلايا الأولية تحمل بوضوح آثارا عملية وطبية أكثر.
في حين أن إجراء ChIP الطويل والمعقد لا يشجع بعض الباحثين على تعلم أو استخدام هذه التقنية ، فإن الناس أكثر راحة مع المقايسات الأسهل مثل الكيمياء المناعية (ICC) أو التألق المناعي (IF). يشبه اختبار CUT &Tag بشكل أساسي عملية تجارب ICC و IF ولكنه يحدث فقط في أنبوب اختبار. لا يحتاج CUT&Tag إلى كروماتين مجزأ ليبدأ به ، وبدلا من ذلك ، يجب أن يكون الجينوم سليما لربط الأجسام المضادة1. في اليوم الأول من تجربة ChIP ، يقضي الباحثون عادة ما يصل إلى 4 ساعات في تحضير الكروماتين المجزأ من النوى باستخدام صوتنة أو هضم MNase قبل خلط قطع الكروماتين القصيرة مع حبات الأجسام المضادة 4,5. في تناقض ملحوظ ، فإن عبء العمل في اليوم الأول لإجراء CUT &Tag هو مجرد شل حركة الخلايا إلى حبات Concanavalin-A ثم إضافة الجسم المضاد الأساسي إلى حبات الخلية. هذا يتطلب فقط ~ 40 دقيقة1.
ومن الجدير بالذكر أن الانقسام تحت الأهداف والإطلاق باستخدام النيوكلياز (CUT&RUN) هو بديل مهم ل CUT&Tag. تم إنشاء CUT &RUN بناء على آلية عمل مماثلة ل CUT&Tag. في CUT&Tag ، توجه الأجسام المضادة ترانسبوزاز pA / G-Tn5 إلى جميع المواقع التي يقوم فيها كل إنزيم بقطع قطعة من الكروماتين وفي الوقت نفسه وضع علامة عليها باستخدام محولات صنع المكتبة ، بينما في CUT &RUN ، يتم لعب دور pA / G-Tn5 بواسطة pA / G-MNase الذي يؤدي فقط جزء القطع من المهمة6. لذلك ، بالمقارنة مع CUT &Tag ، يتطلب CUT &RUN خطوة إضافية وهي لصق محولات صنع المكتبة على قطع الحمض النووي المجزأة pA / G-MNase 7,8. نظرا لأوجه التشابه العالية بين CUT&Tag و CUT&RUN ، فإن الباحثين المطلعين على CUT&Tag سوف يتكيفون بسهولة مع أداء CUT &RUN بكفاءة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى وجود بعض الاختلافات الطفيفة بين CUT &Tag و CUT &RUN. تستخدم بروتوكولات CUT &RUN عادة التركيز المادي للملح (~ 150 mM) في خطوات الغسيل ، بينما في CUT &Tag ، يكون مخزن الغسيل المؤقت 300-Dig غنيا بالملح. لذلك ، فإن CUT &Tag جيد في التحكم في الخلفية عند تحديد سمات / متغيرات الهستون أو عوامل النسخ ، حيث ترتبط هذه البروتينات بشكل مباشر وقوي بالحمض النووي1. قد يواجه CUT&Tag مشاكل عند تنميط العوامل المرتبطة بالكروماتين التي لا تربط الحمض النووي مباشرة وتظهر تقاربا ضعيفا مع الكروماتين. قد تؤدي خطوات الغسيل عالية الملح في CUT&Tag إلى تجريد العوامل المرتبطة بالكروماتين ولا تسبب أي إشارات في الإخراج النهائي. على الرغم من وجود حالات ناجحة حيث يمكن استخدام CUT&Tag لتعريف بعض البروتينات غير الهستونية / غير النسخية9 ، ما زلنا نوصي ب CUT &RUN عبر CUT&Tag لتعريف البروتينات المرتبطة بالكروماتين المرتبطة بشكل ضعيف.
بعد بلوغ الثدييات مرحلة البلوغ، لا تزال أنسجة عضلاتها الهيكلية تحتوي على خلايا جذعية عضلية. أثناء إصابة العضلات ، يمكن تنشيط هذه الخلايا الجذعية والخضوع لتوسيع عدد الخلايا والتمايز لتجديد ألياف العضلات التالفة10. تعرف هذه الخلايا الجذعية باسم الخلايا الجذعية / الساتلية العضلية (MuSCs). بعد عزل MuSCs من أو تنشيطها مرة واحدة عن طريق إصابة العضلات ، فإنها تبدأ في التكاثر وتصبح الأرومات العضلية.
للحصول على MuSCs من هضم العضلات الهيكلية للفأر ، غالبا ما تستخدم علامات سطح MuSC مثل Vcam1 (Cd106) و Cd34 و α7-integrin (Itga7) بشكل فردي أو في مجموعات لإثراء MuSCs أثناء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) 11. لقد ثبت أن Cd31- / Cd45- / Sca1- / Vcam1 + هو على الأرجح أفضل مزيج علامات للحصول على >95٪ MuSCsنقية 12. يمكن ل FACS عزل MuSCs النقية مباشرة بعد هضم العضلات الطازجة. ومع ذلك ، إذا كان التصميم التجريبي لا يتطلب MuSCs نقية عند عزلها مباشرة ، فإن الطلاء المسبق يكون أكثر فعالية من حيث التكلفة من FACS للحصول على >90٪ من الخلايا العضلية النقية (ذرية MuSC).
لا تتكاثر MuSCs المعزولة حديثا من الفئران بكفاءة في وسائط Ham's F10 المكملة بمصل الأبقار الجنيني (FBS). لتوسيع عدد خلايا MuSCs بشكل أفضل والحصول على عدد كاف من الخلايا العضلية ، يجب استخدام مصل نمو الأبقار (BGS) بدلا من FBS. ومع ذلك ، إذا لم يكن BGS متاحا ، فيمكن خلط وسائط Ham's F10 الكاملة (التي تحتوي على حوالي 20٪ FBS) مع حجم متساو من الوسائط الشرطية للخلايا التائية لتعزيز توسع الخلايا العضلية13 بشكل كبير. لذلك ، سيصف هذا البروتوكول أيضا تحضير وسائط MuSC المكيفة لوسائط الخلايا التائية.
الأهم من ذلك ، يوفر هذا البروتوكول مثالا كاملا على إجراء فحوصات H3K4me1 CUT &Tag على الأرومات العضلية للفأر المعزولة من عضلات الأطراف الخلفية للفأر. يرجى ملاحظة أن هذا البروتوكول ينطبق أيضا على أنواع الخلايا الأخرى وعلامات الهستون ومتغيرات الهستون ، ويحتاج القراء فقط إلى تحسين أرقام الخلايا أو كميات الأجسام المضادة لحالاتهم بناء على إثراء علامات أو متغيرات هيستون المحددة التي يدرسونها.
من أجل استخدامها في CUT&Tag أو CUT&RUN، يجب دمج Tn5 أو MNase مع البروتين A أو البروتين G لصنع pA-Tn5 أو pG-Tn5 أو pA-MNase أو pG-MNase. على ما يبدو ، يمكن دمج كل من البروتين A والبروتين G على هذه الإنزيمات في نفس الوقت لتوليد pA / G-Tn5 أو pA / G-MNase. يظهر البروتين A والبروتين G تقاربات تفاضلية مع IgGs من أنواع مختلفة. ومن ثم، فإن دمج البروتين A والبروتين G تماما في الإنزيم يمكن أن يتغلب على هذه المشكلة ويجعل الإنزيم متوافقا مع الأجسام المضادة من أنواع متعددة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A beads</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>BP531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me1 antibody&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperactive Universal CUT&#38;Tag Assay Kit for Illumina&#160;</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD903</td>
			<td>This kit has been tested by us to function well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes</td>
			<td>Qualityard</td>
			<td>QYM06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack for 8-PCR tube stripes</td>
			<td>Anosun Magnetic</td>
			<td>CLJ16/21-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0541L</td>
			<td>For library-making PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pA-Tn5</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>S603-01</td>
			<td>Needs to be mounted with adaptors before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST535-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)</td>
			<td>Antibodies-online</td>
			<td>ABIN101961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Index Kit V2 for Illumina&#160;</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD202</td>
			<td>This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAHTS DNA Clean Beads&#160;</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>N411</td>
			<td>Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&#38;Tag libraries and select DNA fragments by size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using cleavage under targets and tagmentation (cut&#38;tag) assay in mouse myoblast research

تهدف ورقة البروتوكول هذه إلى تزويد الباحثين الجدد بالتفاصيل الكاملة لاستخدام الانقسام تحت الأهداف والوسم (CUT&Tag) لتحديد المواقع الجينومية لعوامل ربط الكروماتين وعلامات الهستون ومتغيرات الهستون. تعمل بروتوكولات CUT&Tag بشكل جيد للغاية مع الخلايا العضلية للفأر والخلايا الجذعية العضلية المعزولة حديثا (MuSCs). يمكن تطبيقها بسهولة على العديد من أنواع الخلايا الأخرى طالما يمكن تجميد الخلايا بواسطة حبات Concanavalin-A. بالمقارنة مع CUT &Tag ، فإن فحوصات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) هي تجارب تستغرق وقتا طويلا. تتطلب فحوصات ChIP المعالجة المسبقة للكروماتين قبل استخدام المادة اللونية للترسيب المناعي. في ChIP عبر الربط (X-ChIP) ، تتضمن المعالجة المسبقة للكروماتين الربط المتقاطع والصوتنة لتفتيت الكروماتين. في حالة ChIP الأصلي (N-ChIP) ، يتم تحقيق الكروماتين المجزأ عادة عن طريق هضم نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase). يقدم كل من صوتنة وهضم MNase بعض التحيز لتجارب ChIP. يمكن الانتهاء من فحوصات CUT &Tag في خطوات أقل وتتطلب خلايا أقل بكثير مقارنة ب ChIPs ولكنها توفر معلومات أكثر غير متحيزة حول عوامل النسخ أو علامات الهستون في مواقع جينومية مختلفة. يمكن أن يعمل CUT&Tag مع ما لا يقل عن 5000 خلية. نظرا لحساسيتها العالية وإشارة الخلفية الأقل من ChIPs ، يمكن للباحثين توقع الحصول على بيانات ذروة موثوقة من عدة ملايين من القراءات بعد التسلسل.

CUT&#38;Tag assay was invented to compensate for some overt flaws of ChIPs1. The two major disadvantages of ChIPs are 1) the bias introduced when fragmenting chromatin and 2) the incompetence to work with low cell numbers. X-ChIP assays rely on either sonication or MNase digestion to get chromatin fragments, whereas N-ChIP mostly uses MNase digestion to get nucleosomes. Sonication shows a bias towards relaxed chromatin locations such as promoter regions2, and apparently, MNase digestion also works more efficiently on relaxed chromatin fibers. Moreover, some reported that MNase digestion also shows a DNA sequence-dependent bias3. Therefore, at the input preparation step of ChIP assays, it is impossible to get chromatin fragments from all kinds of genomic locations in a perfectly random manner. Moreover, ChIP assays normally generate higher background signals compared to CUT&#38;Tag and require over 10 folds more reads than CUT&#38;Tag to accentuate where the peaks are1,4,5. This explains why ChIP experiments have to start with tremendously more cells than CUT&#38;Tag. This is not a problem when studying cell lines as they can be repetitively passaged to achieve a very high cell number. However, the ChIP assay is definitely not a strong epigenetic tool to study rare or precious primary cell populations, although primary cells obviously hold more practical and medical implications.
While the long and complicated ChIP procedure discourages some researchers from learning or using this technique, people are more comfortable with easier assays such as immunocytochemistry (ICC) or immunofluorescence (IF). A CUT&#38;Tag assay essentially resembles the process of ICC and IF experiments but only takes place in a test tube. CUT&#38;Tag does not need fragmented chromatin to start with, and instead, the genome must be intact for antibody binding1. On the first day of a ChIP experiment, researchers normally spend up to 4 h preparing the fragmented chromatins from nuclei with sonication or MNase digestion before the short chromatin pieces can be mixed with antibody-beads4,5. In remarkable contrast, the first-day workload of a CUT&#38;Tag procedure is to just immobilize the cells to Concanavalin-A beads and then to add the primary antibody onto the cell-beads. This only requires ~40 min1.
It is worth mentioning that Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&#38;RUN) is an important alternative to CUT&#38;Tag. CUT&#38;RUN was established based on a similar working mechanism as CUT&#38;Tag. In CUT&#38;Tag, the antibodies guide the pA/G-Tn5 transposase to all the locations where the enzyme will each cut out a piece of chromatin and meanwhile tag it with library-making adaptors, while in CUT&#38;RUN, the role of pA/G-Tn5 is played by the pA/G-MNase which only performs the cutting part of the job6. Therefore, compared to CUT&#38;Tag, CUT&#38;RUN requires an additional step which is to glue the library-making adaptors onto the pA/G-MNase-fragmented DNA pieces7,8. Due to the high similarities between CUT&#38;Tag and CUT&#38;RUN, researchers familiar with CUT&#38;Tag will easily adapt themselves to performing CUT&#38;RUN proficiently. However, it should be noted that some minor differences exist between CUT&#38;Tag and CUT&#38;RUN. CUT&#38;RUN protocols normally use the physical concentration of salt (~150 mM) in the washing steps, while in CUT&#38;Tag, the 300-Dig wash buffer is high in salt. Therefore, CUT&#38;Tag is good at controlling the background when profiling histone marks/variants or transcription factors, as these proteins directly and strongly bind DNA1. CUT&#38;Tag may run into problems when profiling chromatin-associated factors that do not directly bind DNA and show weak affinity to the chromatin. High salt washing steps in CUT&#38;Tag may strip off chromatin-associated factors and cause no signals in the final output. Although there are successful cases where CUT&#38;Tag can be used to profile some non-histone/non-transcription factor proteins9, we still recommend CUT&#38;RUN over CUT&#38;Tag to profile weakly-bound chromatin-associated proteins.
After mammals reach adulthood, their skeletal muscle tissues still contain muscle stem cells. During muscle injury, these stem cells can be activated and undergo cell number expansion and differentiation to regenerate damaged muscle fibers10. These stem cells are known as Muscle stem/satellite cells (MuSCs). After MuSCs are isolated from animals or once activated by muscle injury, they start proliferating and become myoblasts.
To obtain MuSCs from mouse skeletal muscle digest, MuSC surface markers such as Vcam1 (Cd106), Cd34, and &#945;7-integrin (Itga7) are often used individually or in combinations to enrich MuSCs during fluorescence-activated cell sorting (FACS)11. It has been shown that Cd31-/Cd45-/Sca1-/Vcam1+ is probably the best marker combination to get &#62;95% pure MuSCs12. FACS can isolate pure MuSCs right after fresh muscles are digested. However, if the experimental design does not require pure MuSCs right at their isolation, pre-plating is more cost-effective than FACS to obtain &#62;90% pure myoblasts (MuSC progeny).
MuSCs freshly isolated from mice do not proliferate efficiently in Ham&#39;s F10 media supplemented with fetal bovine serum (FBS). To better expand the cell number of MuSCs and get sufficient myoblasts, bovine growth serum (BGS) should be used instead of FBS. However, if BGS is not available, Ham&#39;s F10 full media (containing about 20% FBS) can be mixed with an equal volume of T-cell conditional media to dramatically promote myoblast expansion13. Therefore, this protocol will also describe the preparation of T-cell media conditioned MuSC media.
Most importantly, this protocol provides a complete example of performing H3K4me1 CUT&#38;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles. Please note that this protocol also applies to other cell types and histone marks and histone variants, and readers only need to optimize the cell numbers or antibody amounts for their cases based on the enrichment of the specific histone marks or variants they study.
In order to be used in CUT&#38;Tag or CUT&#38;RUN, the Tn5 or MNase needs to be fused with protein A or protein G to make pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase, or pG-MNase. Apparently, both protein A and protein G can be fused onto these enzymes at the same time to generate pA/G-Tn5 or pA/G-MNase. Protein A and protein G show differential affinities to IgGs from different species. Therefore, fusing protein A and protein G altogether onto the enzyme can overcome this problem and make the enzyme compatible with antibodies from multiple species.

تسليط الضوء على المؤلف: التنقل في التحديات والابتكارات في دراسات الخلايا الجذعية العضلية

استخدام الانقسام تحت الأهداف ومقايسة العلامات (CUT &#38;Tag) في أبحاث الأرومة العضلية للفأر

Our group's research focuses on how genome structure, and transcription, in adult skeletal muscle stem cells are regulated and maintained, particularly during sulfate changes, like stem cell commitment, differentiation, and tinasis. Adult skeletal muscle stem cells, comprising just 1%of mono nucleated cells in muscle tissue, present a challenge for chromatin feature studies using High-C, ChIPs, and ATAC seq, due to their scarcity in single cell suspensions obtained from muscle digestion. Chromatin immuno-precipitation, ChIP, has been a key tool for profiling genome features.A simpler, more efficient cut&tag technique, developed by Dr.Steven Henikoff, often surpasses ChIP, especially in studying epigenetics in rare cell populations. Its ease of use broadens accessibility for researchers, including non epigenetic experts.

قبل ربط الخلايا بخرز Concanavalin-A ، تحقق من تعليق الخلية تحت المجهر. وفقا لذلك ، بعد احتضان الخلايا باستخدام حبات Concanavalin-A ، ضع أنابيب العينة على الرف المغناطيسي ، ويجب ملاحظة المادة الطافية مرة أخرى باستخدام المجهر. هذا لتقييم مدى كفاءة التقاط الخلايا بواسطة حبات Concanavalin-A. يجب أن يبدو المخزن ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Navigating Challenges and Innovations in Muscle Stem Cell Studies at JoVE.com

سيجد الباحثون الجدد في مجال الوراثة اللاجينية أن CUT&Tag بديل أسهل بكثير لمقايسات ChIP. استفادت CUT&Tag بشكل كبير من الدراسات اللاجينية على مجموعات الخلايا النادرة والأولية ، مما أدى إلى توليد بيانات عالية الجودة من عدد قليل جدا من الخلايا. يصف هذا البروتوكول إجراء فحوصات H3K4me1 CUT&Tag على الخلايا العضلية للفأر المعزولة من عضلات الأطراف الخلفية للفأر.

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

تركز أبحاث مجموعتنا على كيفية تنظيم بنية الجينوم والنسخ في الخلايا الجذعية للعضلات الهيكلية البالغة والحفاظ عليها ، خاصة أثناء تغيرات الكبريتات ، مثل التزام الخلايا الجذعية والتمايز و tinasis. تمثل الخلايا الجذعية للعضلات الهيكلية البالغة ، التي تضم 1٪ فقط من الخلايا أحادية النواة في الأنسجة العضلية ، تحديا لدراسات ميزات الكروماتين باستخدام تسلسل High-C و ChIPs و ATAC ، نظرا لندرتها في معلقات الخلية المفردة التي تم الحصول عليها من هضم العضلات. كان الترسيب المناعي للكروماتين ، ChIP ، أداة رئيسية لتحديد سمات الجينوم.غالبا ما تتفوق تقنية القطع والعلامات الأبسط والأكثر كفاءة ، التي طورها الدكتور ستيفن هينيكوف ، على ChIP ، خاصة في دراسة علم التخلق في مجموعات الخلايا النادرة. سهولة استخدامه توسع إمكانية الوصول للباحثين ، بما في ذلك الخبراء غير اللاجينيين.

using-cleavage-under-targets-tagmentation-cut-tag-assay-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

388 Views.  Guangzhou Laboratory. تركز أبحاث مجموعتنا على كيفية تنظيم بنية الجينوم والنسخ في الخلايا الجذعية للعضلات الهيكلية البالغة والحفاظ عليها ، خاصة أثناء تغيرات الكبريتات ، مثل التزام الخلايا الجذعية والتمايز و tinasis. تمثل الخلايا الجذعية للعضلات الهيكلية البالغة ، التي تضم 1٪ فقط من الخلايا أحادية ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: التنقل في التحديات والابتكارات في دراسات الخلايا الجذعية العضلية

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile the genomic locations of chromatin binding factors, histone marks, and histone variants. CUT&amp;Tag protocols function very well with mouse myoblasts and freshly isolated muscle stem cells (MuSCs). They can easily be applied to many other cell types as long as the cells can be immobilized by Concanavalin-A beads. Compared to CUT&amp;Tag, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are time-consuming experiments. ChIP assays require the pre-treatment of chromatin before the chromatic material can be used for immunoprecipitation. In cross-linking ChIP (X-ChIP), pre-treatment of chromatin involves cross-linking and sonication to fragment the chromatin. In the case of native ChIP (N-ChIP), the fragmented chromatins are normally achieved by Micrococcal nuclease (MNase) digestion. Both sonication and MNase digestion introduce some bias to the ChIP experiments. CUT&amp;Tag assays can be finished within fewer steps and require much fewer cells compared to ChIPs but provide more unbiased information on transcription factors or histone marks at various genomic locations. CUT&amp;Tag can function with as few as 5,000 cells. Due to its higher sensitivity and lower background signal than ChIPs, researchers can expect to obtain reliable peak data from merely several millions of reads after sequencing.

Researchers new to the epigenetic field will find CUT&amp;Tag a significantly easier alternative to ChIP assays. CUT&amp;Tag has tremendously benefited the epigenetic studies on rare and primary cell populations, generating high-quality data from very few cells. This protocol describes performing H3K4me1 CUT&amp;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles.