للبدء ، قم بتسمية ثلاث مجموعات من الأنابيب المعقمة سعة 1.7 ملليلتر ومجموعة واحدة من الأنابيب السفلية المخروطية المعقمة سعة 15 ملليلتر. قم بإعداد جهاز طرد مركزي دلو متأرجح مع إدخالات أنبوب سعة 15 ملليلتر وتبريده مسبقا إلى أربع درجات مئوية. خذ لوحة زراعة الخلايا المكونة من ستة آبار مع خلايا 293 قدما منقولة.
نضح وسائل الإعلام من الآبار. أضف 250 ميكرولتر من التربسين-EDTA واحتضانها عند 37 درجة حتى تبدأ الخلايا في الانفصال. ثم أضف ملليلتر واحد من وسائط الفحص المكملة بنسبة 10٪ FBS إلى كل بئر وماصة بقوة لإنشاء تعليق أحادي الخلية.
انقل ملليلترا واحدا من معلق الخلية إلى أنابيب سعة 15 ملليلتر مصنفة مسبقا. أضف ملليلتر واحد من وسائط الفحص المكملة بنسبة 10٪ FBS إلى كل من هذه الأنابيب واقلبها خمس مرات للخلط. ثم قم على الفور بنقل 20 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى مجموعة الأنبوب الأولى.
الآن أجهزة الطرد المركزي أنابيب 15 ملليلتر لمدة خمس دقائق في 250 غرام في أجهزة الطرد المركزي المبردة مسبقا. امزج 20 ميكرولترا من صبغة الخلايا الزرقاء المريبانية مع الخلايا في المجموعة الأولى وعد باستخدام عداد الخلايا أو مقياس الدم. بعد إزالة أنابيب 15 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي ، قم بشفط الوسائط من كريات الخلايا وإعادة تعليق الكريات في وسائط فحص خالية من المصل لإنشاء تعليق أحادي الخلية.
لإعادة الخلايا في صفائح 384 بئرا وستة آبار ، اقلب الأنابيب سعة 15 ملليلترا عدة مرات للحصول على تعليق خلية متجانس وانقل أنابيب 500 ميكرولتر إلى 1.7 ملليلتر في المجموعة الثانية والمجموعة الثالثة. أضف 0.5 ميكرولتر من DMSO لضبط اثنين و 0.5 ميكرولتر من Halo 618 ligand إلى الأنبوب ثلاثة واخلطه جيدا. نقل DMSO ومعلقات الخلايا الإيجابية لليجند إلى آبار منفصلة من خزانات الكاشف.
استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 40 ميكرولترا من كل تعليق إلى لوحة الاستزراع 384 بئرا. نقل الخلايا المتبقية إلى لوحات استزراع جديدة من ستة آبار لتحليل اللطخة الغربية اللاحقة واحتضان كل من 384 بئرا وستة آبار بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. خذ وسائط فحص خالية من المصل مسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية.
قم بتخفيف ركيزة nanoluciferase المذابة 1: 100 في وسائط فحص خالية من المصل ونقلها إلى خزان الكاشف. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 10 ميكرولتر من خليط الركيزة إلى كل بئر من لوحة الاستزراع المكونة من 384 بئرا. قم بتدوير اللوحة برفق لمدة دقيقة واحدة.
أدخل لوحة 384 بئرا في قارئ لوحة متعدد الأوضاع وسجل انبعاثات 460 و 618 نانومتر من جميع الآبار التي تحتوي على خلايا. احسب نسب BRET الخام للمركبة الموجبة و ligand-positive بوحدات milliBRET باستخدام المعادلة المعطاة. احسب نسبة BRET المصححة عن طريق طرح نسبة BRET الموجبة للمركبة من نسبة الرباط الموجبة.
يقلل متحولة CRAFS259A النانوية من إشارة BRET بنسبة 45٪ تقريبا ومتحولة CRAFS621A النانوية بحوالي 25٪ ، ويزيل الطافر المزدوج إشارة BRET تقريبا.
