للبدء ، قم بإعداد حاملات المشابك والمشابك المعدنية. ضع حوامل المشابك المطابقة مع مشبك معدني واحد لكل منها في محطة التثبيت. ضع قطع الورق المعقم المبللة فوق المشابك المعدنية.
قطع الورق على طول الحدود الداخلية للمشابك مع مشرط. قص قطعتين ورقيتين صغيرتين إضافيتين وأبقيهما رطبتين. باستخدام ملاقط مدببة ، ضع ثمانية نباتات أساسية على الورق بين المشابك المعدنية مع نقاط نهايتها على المشابك.
قم بتغطية نقاط نهاية النباتات الأساسية بقطع ورقية أصغر وضع المشابك المعدنية في الأعلى. استخدم مفك براغي ومسامير صغيرة لتثبيت النباتات الأساسية بين المشابك المعدنية وحامل المشبك. انقل بعناية النباتات الأساسية المثبتة إلى غرف زراعة السيليكون واملأ هذه الغرف بملليلتر من وسط زراعة الخلايا القياسي.
ثم تثبيت التجميع مع مسامير إضافية. لتحضير هيدروجيل الكولاجين ، قم أولا بإزالة الخلايا المستهدفة من أطباق زراعة الأنسجة باستخدام محلول انفصال الخلايا. ثم أجهزة الطرد المركزي عند 400 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم يعاد تعليقها في ملليلتر واحد من وسط الاستزراع القياسي.
بعد ذلك ، قم بإعداد محلول ربط متقاطع عن طريق خلط 10 ميكرولتر من PBS ، و 1.28 ميكرولتر من ضرس واحد NaOH ، و 8.72 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لكل تجميع. أضف تعليق الخلية لما يصل إلى 12 مجموعة وضع الأنبوب على الثلج. اضبط تعليق الخلية بحيث يتم تحقيق التركيزات النهائية التالية.
قم بإعداد محلول واحد للكولاجين بشكل منفصل عن طريق إضافة 80 ميكرولتر من الكولاجين لكل تجميع ووضع الأنبوب على الجليد. بمجرد أن تصبح المحاليل جاهزة على الجليد ، قم باستنشاق وسط زراعة الخلايا من الغرف التي تحتوي على النباتات الأساسية المثبتة. أضف محلول الكولاجين إلى محلول الربط المتقاطع واخلطه عن طريق السحب بسرعة دون تكوين فقاعات.
أضف 200 ميكرولتر من المحلول المختلط إلى الأخاديد الموجودة في غرف السيليكون لتغطية نباتات الأوتار الفردية. دع الهلاميات المائية تتبلمر لمدة 50 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم املأ غرف زراعة السيليكون بعناية ب 1.5 ملليلتر من وسيط الاستزراع المشترك المعني عن طريق سحبه في زوايا الغرف.
ضع الغرف في طبق بتري كبير أو صندوق معقم قبل وضعها في حاضنة. ثقافة التجمعات في الظروف المناسبة ، وتغيير وسط الثقافة مرتين في الأسبوع. إزالة التجميعات من المشابك بالمقص.
إذا لزم الأمر ، استخدم الملقط لفصل النباتات الأساسية عن حجرة الهيدروجيل الخارجية. عند استزراع التجميع في ظروف استزراع شبيهة بالآفة لأكثر من 21 يوما ، لوحظ أن الزرع الأساسي ظل قابلا للتمدد ميكانيكيا ، ولم يتغير في المظهر ، ويمكن تمييزه بصريا ويمكن فصله جسديا عن الهيدروجيل المحيط. علاوة على ذلك ، يتم ضغط الهيدروجيل المحيط بمرور الوقت ، اعتمادا على عدد الخلايا المصنفة مع الخلايا الليفية المشتقة من وتر العرقوب التي تقلص الهيدروجيل المحيط بها بشكل أسرع.
كشف تقييم الفحص المجهري متحد البؤر للجدوى والتشكل وانتشار الخلايا في هيدروجيل الكولاجين 3D أنه تم الاحتفاظ بالجدوى خلال ثقافة التجميع حتى اليوم السابع على الأقل. علاوة على ذلك ، زاد التعبير الجيني ل Vegfa و Mmps بقوة في النباتات الأساسية كما يتضح من التحليل النسخي. وبالمثل ، كشف تحليل الإفراز عن وجود السيتوكينات مثل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية في النباتات الأساسية.
