للبدء ، قم بتشغيل خزانة تدفق الهواء الصفحي ، مما يسمح لها بالاستقرار لمدة ثلاث دقائق. قم بتنظيف وتعقيم الأسطح الداخلية للخزانة باستخدام عوامل التطهير التالية. بعد تطهير أي مادة تدخل الخزانة ، ضع المناديل وقفازات النتريل في الخزانة.
ثم أغلق الخزانة وعرضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. بعد التشعيع ، أعد تشغيل الخزانة. ضع كواشف التصميم التمهيدي في مبرد مملوء بالثلج.
بعد تعقيمه بنسبة 70٪ إيثانول ، ضع الحاوية داخل الخزانة. قم بإعداد التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة ، أو مزيج LAMP ، في أنبوب طرد مركزي دقيق 0.6 ملليلتر. ماصة الخليط لتجانسه.
بعد ذلك ، احتضان الأنابيب المغلقة في كتلة تسخين عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم قم بتبريد الأنابيب في مبرد البوليسترين المملوء بالثلج لمدة خمس دقائق. بعد التبريد ، ضع الأنابيب في خزانة التدفق الصفحي.
لإكمال مزيج LAMP ، أضف أربعة ميكرولترات من بوليميراز الحمض النووي ، متبوعا بميكرولتر واحد من النسخ العكسي. لإجراء الكشف اللوني ، أضف ثنائي هيدروكسي نافثول الأزرق. بعد إضافة الكاشف ، ماصة كل محلول لخلط كواشف LAMP بشكل صحيح.
بعد ذلك ، ماصة 22 ميكرولتر من المحلول في أنابيب PCR ، مع الحرص على عدم إنشاء فقاعات. للتحكم السلبي ، أضف ثلاثة ميكرولترات من 0.1٪ ماء ثنائي إيثيل بيروكربونات. ضع جانبا أي أنابيب متبقية لإضافة المادة الوراثية.
بعد ذلك ، قم بإزالة جميع المواد من الخزانة. بعد تعقيم أسطح الخزانة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، أغلقها. في منطقة منفصلة ، أضف ثلاثة ميكرولترات من العينة إلى كل أنبوب PCR وبئر ماصة باستخدام ماصة صغيرة سعة 20 ميكرولتر للتجانس التام.
قبل بدء التفاعل اللوني ، استخدم كاميرا عالية الجودة لالتقاط صور لأنابيب PCR. الآن ، نفذ التفاعل باستخدام دورة حرارية وحمام مائي. بالنسبة للدورة الحرارية ، ضع الأنابيب في كتلة التفاعل وقم بإعداد ملف تعريف حراري على الجهاز.
في حالة استخدام الحمام المائي ، ضع الأنابيب بإحكام في حاويات دائرية ، ثم ضع هذه الحاويات في حمام مائي عند 66.3 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد وقت التفاعل ، قم بإزالة الأنابيب وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. إذا تم إجراء تفاعل لوني ، التقط صورا ل PCR بكاميرا عالية الجودة.
أظهر تدرج درجة الحرارة أن درجة الحرارة المثلى للانصهار هي 66.3 درجة سلزية. تم تحسين تركيز إنزيم BST 3.0 إلى 3.2 وحدة دولية لكل ميكرولتر. لتحديد استراتيجية القياس اللوني ، تم تقييم الفينول الأحمر في الأصباغ الحمراء المحايدة.
ومع ذلك ، لم يلاحظ أي تغيير في اللون بعد التضخيم. تم إجراء توحيد تركيزات مختلفة من هيدروكسي نافثول الأزرق مع التغيير الأمثل الذي يحدث مع 125 ميكرومول من هيدروكسي نافثول الأزرق. أظهرت العينات المضخمة تغيرا في اللون وفقا لتركيزها.
تم تأكيد تضخيم العينة بشكل أكبر عن طريق الرحلان الكهربائي.
