إعداد معلقات خلية واحدة من 3D متباينة العضوية المعوية البشرية ل Transcriptomics خلية واحدة

للبدء ، قم بإذابة كاشف هضم الخلايا الأنزيمية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تحت مجهر برايت فيلد عند تكبير 10x ، راقب الكائنات العضوية المعوية البشرية ثلاثية الأبعاد المتمايزة لضمان صحة الخلايا. استبدل الوسائط من آبار صفيحة 24 بئرا تحتوي على عضويات متباينة ب 500 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا الباردة.

ماصة صعودا وهبوطا لتحرير الخلايا من الغشاء القاعدي. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. احتضن الأنبوب على الثلج لمدة 10 دقائق ، وسحب السحب لأعلى ولأسفل كل خمس دقائق.

أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 400 غرام لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية من الأنبوب دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من كاشف هضم الخلايا الأنزيمية المسخن مسبقا ، مع سحب الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات.

ضع المواد العضوية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. كل 10 دقائق ، ماصة الحجم بالكامل 10 مرات باستخدام ماصة P1000 للمساعدة في فصل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 400 غرام لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية ، وإعادة تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسائط التمايز.

ماصة سريعة الخلايا صعودا وهبوطا 50 مرة على الجليد لفصل المواد العضوية إلى خلايا واحدة. قم بتصفية الحجم بالكامل من خلال مصفاة طرف 70 ميكرون وجمع الشطف في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. ثم قم بتصفية التجويف الذي تم الحصول عليه من خلال مصفاة 70 ميكرون على مصفاة طرف 40 ميكرون.

أضف خمسة ميكرولترات من 0.4٪ Trypan Blue إلى خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية ، وعد الخلايا المفردة القابلة للحياة باستخدام استبعاد Trypan Blue. قم بتخفيف العينة باستخدام وسائط زراعة الخلايا للحصول على 1000 خلية لكل ميكرولتر. تم عزل ما مجموعه 4،402 خلية مفردة من عضويات معوية بشرية ثلاثية الأبعاد متمايزة ، تمثل أنواع الخلايا المتوقعة ، بما في ذلك الخلايا المعوية الامتصاصية والخلايا الإفرازية.