تحضير معلقات أحادية الخلية من عضويات معوية بشرية متباينة على أنها 96 طبقة أحادية الطبقة جيدا

للبدء ، قم بإعداد كاشف هضم الخلايا الأنزيمية و PBS / EDTA لهضم الكائنات العضوية المعوية البشرية. تحت مجهر برايتفيلد ، تأكد من نمو الكائنات العضوية المعوية البشرية ثلاثية الأبعاد المتباينة كطبقة أحادية. تخلص من وسائط زراعة الخلايا من الثقافة أحادية الطبقة واستبدلها ب 100 ميكرولتر من PBS / EDTA.

بعد إزالة PBS / EDTA ، أضف 100 ميكرولتر من كاشف هضم الخلايا الأنزيمية الدافئة إلى كل بئر. ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ وماصة الحجم بالكامل خمس مرات كل 10 دقائق لمدة 20 إلى 30 دقيقة. انقل ميكرولترا إلى اثنين ميكرولتر من تعليق الخلية إلى شريحة زجاجية كل 10 دقائق لتقييم التفكك من خلال مراقبة النسبة المئوية للخلايا المفردة.

بعد التفكك ، اجمع بين ثلاثة آبار مكررة لكل حالة في أنبوب طرد مركزي واحد سعة 1.5 ملليلتر. أضف 700 ميكرولتر من وسط تمايز زراعة الخلايا الذي يحتوي على مثبط 10 ميكرومولار ROCK ، واخلطه برفق عن طريق الماصة. قم بتصفية الحجم بالكامل من خلال مصفاة طرف 70 ميكرون ، وجمع التدفق في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر.

قم بتصفية التدفق الذي تم الحصول عليه من خلال مصفاة 70 ميكرون على مصفاة طرف 40 ميكرون. أضف خمسة ميكرولترات من 0.4٪ Trypan Blue إلى خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية ، وعد الخلايا المفردة القابلة للحياة. تمييع العينة مع وسائط زراعة الخلايا التي تحتوي على مثبطات ROCK للحصول على 1،000 خلية لكل ميكرولتر.

تم عزل ما مجموعه 9،952 خلية مفردة من عضويات معوية بشرية معوية متمايزة نمت في 96 صفيحة بئر.