تحضير معلقات أحادية الخلية من عضويات معوية بشرية متباينة على إدراج زراعة الخلايا الغشائية

للبدء ، ضع الأنبوب سعة 15 ملليلترا الذي يحتوي على كاشف هضم الخلايا الأنزيمية المسخن مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. قسمة 500 ميكرولتر من PBS / EDTA المحضرة حديثا في آبار 24 صفيحة بئر. تحت مجهر برايت فيلد ، لاحظ نمو الكائنات العضوية المعوية البشرية ثلاثية الأبعاد المتباينة و transwells.

انقل إدخالات زراعة الخلايا من وسائط النمو إلى محلول PBS / EDTA. قم بإزالة وسائط الاستزراع من الجانب القمي واستبدلها ب 100 ميكرولتر من PBS / EDTA دون إزعاج طبقة الخلية. بعد التخلص من PBS / EDTA ، قم بإزالة الملحق من البئر ، وامسحه برفق على حافة منشفة ورقية وقم بقلبه على سطح الطاولة.

باستخدام شفرة مشرط حادة ، قم بقص المحيط الداخلي للغشاء لإزالة الغشاء من الإدخال. نقل الغشاء مع ملقط إلى أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على 200 ميكرولتر من كاشف هضم الخلايا الأنزيمية الدافئة مسبقا. ضع الغشاء لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.

كل 10 دقائق ، ماصة الحجم بأكمله خمس مرات باستخدام ماصة P 200. نقل واحد إلى اثنين ميكرولتر من تعليق الخلية إلى شريحة زجاجية كل 10 دقائق لتقييم التفكك عن طريق التقييم النوعي للنسبة المئوية للخلايا المفردة. بعد التفكك ، اجمع بين ثلاثة آبار مكررة لكل حالة في أنبوب طرد مركزي صغير واحد سعة 1.5 ملليلتر.

أضف 400 ميكرولتر من وسط تمايز زراعة الخلايا الذي يحتوي على مثبط 10 ميكرومولار ROCK واخلطه برفق عن طريق الماصة. قم بتصفية الحجم بالكامل من خلال مصفاة طرف 70 ميكرون ، وجمع التدفق في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. ثم قم بتصفية التدفق الذي تم الحصول عليه من خلال مصفاة 70 ميكرون على مصفاة طرف 40 ميكرون.

أضف خمسة ميكرولترات من 0.4٪ تريبان أزرق إلى خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية وعد الخلايا المفردة القابلة للحياة. قم بتخفيف العينة باستخدام وسط نمو WRNE للحصول على 1،000 خلية لكل ميكرولتر. تم عزل ما مجموعه 5،623 خلية مفردة من عضويات معوية بشرية صائمية متباينة نمت على إدخالات زراعة الخلايا الغشائية.