للبدء ، قم بزرع الخلايا HEK293T في مصنع خلايا مكون من 10 طبقات يحتوي على وسائط DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS. ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت مكملات ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ طوال الليل. بعد ذلك ، قم بقسمة 350 ملليلتر من Opti-MEM في زجاجة معقمة سعة 500 ملليلتر.
أضف الحمض النووي للبلازما لنقله إلى الزجاجة ورجه حتى يمتزج جيدا. أضف الآن 15 ملليلتر من محلول PEI في الزجاجة. رج المزيج بقوة لمدة 30 ثانية لضمان الخلط المتساوي.
بعد احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، انقله إلى زجاجة سعة لتر واحد. ثم أضف 700 ملليلتر من DMEM منخفض الجلوكوز. قم بإزالة مصنع الخلايا المكون من 10 طبقات من الحاضنة وقم بتفريغ الوسائط في حاوية نفايات.
ماصة بعناية نقل خليط الحمض النووي إلى مصنع الخلية. ثم ضع مصنع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 72 إلى 96 ساعة. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام ، قم بتصفية المادة الطافية الموضحة من خلال وحدة تصفية 0.45 ميكرومتر.
أضف 500 ملليلتر من DPBS إلى مصنع الخلايا لشطفه. أجهزة الطرد المركزي في 4،000 غرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. مع نظام فراغ وماصة شفط ، قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية.
أضف 20 ملليلترا من AAV Lysis Buffer إلى الحبيبات واخلطها لإعادة تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت. يحفظ في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم تنقيته. أضف الآن 40٪ محلول كلوريد الصوديوم PEG إلى محلول AAV ، مما يجعل التركيز النهائي يصل إلى 8٪ PEG.
ضع الخليط على دوار مداري منخفض السرعة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. جهاز طرد مركزي من الحل في 4،000 غرام لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لترسيب الفيروس. ماصة من طاف.
ثم كان لديه خمسة إلى 10 ملليلتر من AAV HEPES Resuspension Buffer إلى الحبيبات. انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر لمواصلة تنقية المصب. بعد ذلك ، قم بتثبيت إبرة مثقوبة قياس 16 مثبتة على حقنة سعة 10 ملليلتر وقم بتراكب تدرجات اليوديكسانول المحضرة في أنبوب طرد مركزي فائق من مادة البولي بروبيلين مستديرة.
باستخدام إبرة قياس 22 ، أضف بعناية ما يصل إلى 17 ملليلترا من محلول AAV أعلى التدرج. أعلى قبالة أنبوب مع AAV غسيل الكلى العازلة. ختم الأنابيب مع تسرب الكهربائية.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 350،000 غرام لمدة ساعتين في دوار التيتانيوم عند أربع درجات مئوية. ثم قم بنقلها إلى رف أنبوب الطرد المركزي الفائق. الآن استخدم إبرة جديدة من قياس 18 لنقل فيروس AAV إلى كاسيت غسيل الكلى.
قم بإزالة الهواء من الكاسيت بعد حقن الفيروس فيه. ضع قضيب تقليب في الدورق الذي يحتوي على AAV Dialysis Buffer وانقله إلى طبق التقليب. ثم ضع كاسيت غسيل الكلى في المخزن المؤقت مع عوامة عائمة.
استخدم حقنة سعة 10 ملليلتر لنقل الفيروس من الكاسيت إلى وحدة مرشح بالطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 4،000 غرام لمدة 15 إلى 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اجمع AAV المركز من وحدة التصفية.
ثم شطف الفلتر مع 300 ميكرولتر من AAV غسيل الكلى العازلة. أخيرا ، انقل محلول الشطف إلى AAV المركز. تم العثور على فيروس AVV المعزول ليكون له نقاء أكبر من 90٪ مما يجعله مناسبا للاستخدام في الجسم الحي.
