تفكك الخلايا العصبية الحصين الأولية والطلاء لقياس آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري

ابدأ بتشريح الحصين من دماغ الفأر الجنيني وضع الأنسجة المقطعة في محلول كالسيوم بارد وخالي من المغنيسيوم أو CMF. بعد ذلك ، قم بإزالة CMF وشطف الأنسجة أربع مرات باستخدام CMF البارد الطازج ، مع تدوير الأنبوب برفق بين الشطف. ثم يضاف محلول التربسين المصفى 0.125٪ ويحتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ويحوم كل خمس دقائق.

بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول التربسين واغسله مرتين باستخدام CMF البارد المثلج. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من محلول تعطيل التربسين. بعد ذلك ، لفصل الخلايا ، قم بالمعايرة 30 مرة باستخدام سحبين ثانيين بإبرة قياس 14 متصلة بحقنة ثلاثة ملليلترات.

استمر في المعايرة بالتحليل الحجمي بسحبتين ثانيتين 30 مرة باستخدام إبرة قياس 15، ثم 20 مرة باستخدام إبرة قياس 16، متبوعة ب 20 مرة بإبرة قياس 18. ثم قم بإجراء ثلاث سحوبات ثانية باستخدام إبرة قياس 21 15 مرة لإكمال تفكك الخلايا. تحقق من وجود كتل خلوية عن طريق وضع قطرة من تعليق الخلية على شريحة مجهرية.

بعد ذلك ، قم بتصفية خمسة ملليلتر من FBS باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرون. ضع تعليق الخلية برفق على FBS في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 200 × جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

أزل FBS وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من الوسائط العصبية القاعدية الدافئة الخالية من المضادات الحيوية. تمييع تعليق الخلية في 0.4٪ تريبان الأزرق والحصول على عدد الخلايا. قم بطلاء الخلايا في 750 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية الخالية من المضادات الحيوية في شريحة غرفة 4 بئر مطلية ب poly-D-lysine.

احتضان الخلايا في غرفة يتم التحكم فيها بالرطوبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.