للبدء ، ضع مصفاة 70 ميكرومتر على أنبوب بولي بروبيلين سعة خمسة ملليلتر. ماصة 500 ميكرولتر من وسط الخلية العصبية فوقه. نقل تجانس أنسجة الحصين الفأر المنفصلة إلى الأنبوب من خلال المصفاة.
ثم ماصة ملليلتر واحد من وسط الخلايا العصبية الباردة فوق الخالط مرتين لشطفه. الآن ، أضف 500 ميكرولتر من DPBS البارد المثلج إلى الحبيبات لإعادة تعليقها. تشكل حجم التعليق إلى 1.5 ملليلتر مع DPBS.
ماصة 500 ميكرولتر من محلول بيركول متساوي التوتر للعينة. تراكب الحل مع ملليلتر من DPBS الباردة في أجهزة الطرد المركزي. ثم نضح الطبقة العليا وقرص المايلين في المرحلة الوسطى.
بعد ذلك ، أضف أربعة ملليلتر من DPBS البارد في الأنبوب ، واستنشق المادة الطافية بعد الطرد المركزي. ثم أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الجدوى القابل للإصلاح. ماصة ملليلتر واحد من DPBS البارد إلى العينة قبل الطرد المركزي للعينة عند 300 × جم لمدة خمس دقائق.
بعد استنشاق المادة الطافية ، أضف 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ CD16 و CD32. دوامة العينة لمدة خمس ثوان ، ثم احتضان. بعد الحضانة ، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت FACS إلى العينة وأجهزة الطرد المركزي.
ماصة 100 ميكرولتر من مزيج تلطيخ رئيسي في الأنبوب. ثم احتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. الآن ، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت FACS إلى العينة قبل الطرد المركزي كما كان من قبل.
أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت بعد التخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من المخزن المؤقت للنفاذية إلى الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. ماصة 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ vGLUT1 للحبيبات.
ثم دوامة الخليط لمدة خمس ثوان قبل الحضانة والطرد المركزي. أعد تعليق حبيبات الخلية في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. أخيرا ، قم بتصفية العينات من خلال مرشح 40 ميكرومتر.
لوحظت إشارة فلورية vGLUT1-PE أعلى من الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين مقارنة بالتحكم في النمط المتماثل. تم العثور على إشارة فلورسنت vGLUT1-PE أعلى في الخلايا الدبقية الصغيرة من البصلة الشمية وإشارة أقل في المخيخ مقارنة بالحصين. تم الكشف عن أدنى كثافة إشارة في الضامة الطحال.
