تلطيخ حي / ميت لخلايا العضلات الهيكلية ، معزولة من الفئران المصابة بالملاحظة ، مع تثبيت سيسبلاتين وبارافورمالدهيد

للبدء ، أعد تعليق خلايا العضلات الهيكلية المعزولة من الفئران المصابة ب Notexin الموسومة ب iododeoxyuridine في ملليلتر واحد من DMEM الخالي من المصل البارد وعدها باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا. تحت غطاء الدخان ، أضف مخزون سيسبلاتين لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 25 ميكرومولار. دوامة الأنبوب لمدة 10 ثوان واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

قم بإخماد التفاعل باستخدام DMEM البارد المثلج الذي يحتوي على 10٪ FBS وضعه على الثلج. بعد تكوير الخلايا وتعليقها ، قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 35 ميكرومتر. تحت غطاء الدخان ، أضف محلول مخزون بارافورمالدهايد المصفى لإصلاح تعليق الخلية والدوامة لمدة 30 ثانية.

اغسله مرتين باستخدام ملليلتر من وسط تلطيخ الخلايا أو CSM عن طريق الطرد المركزي. بعد الغسيل النهائي ، قم بشفط المادة الطافية إلى حوالي 60 ميكرولتر وأعد تعليق الحبيبات تماما. أضف 40 ميكرولترا من مزيج تلطيخ الأجسام المضادة السطحية 2.5 مرة المحضر في CSM واحتضانه لمدة ساعة واحدة أثناء دوامتها كل 20 دقيقة.

بعد غسل العينة مرتين باستخدام CSM ، قم بنضح المادة الطافية ونفض الحبيبات. لتخلل الخلايا ، تحت غطاء الدخان ، أضف 0.5 ملليلتر من الميثانول البارد المثلج بالتنقيط أثناء الدوامة. اغسل الخلايا مرتين بالمليلتر الواحد من CSM عن طريق الطرد المركزي.

بعد الغسيل الأخير ، قم بنضح المادة الطافية إلى حوالي 60 ميكرولتر وأعد تعليق الحبيبات جيدا. احتضان الخلايا مع 40 ميكرولتر من مزيج تلطيخ الأجسام المضادة داخل الخلايا لمدة ساعة واحدة ، في حين دوامة العينات كل 20 دقيقة. بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام ملليلتر واحد CSM ، أعد تعليق العينات في 0.5 ملليلتر من محلول الإيريديوم والدوامة.