للبدء ، خذ خلايا العضلات الهيكلية الملطخة بالسيسبلاتين ، والأجسام المضادة المعدنية المترافقة ، ومحلول الإيريديوم المتداخل ، وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بمجرد إزالة المادة الطافية ، أضف ملليلتر واحد من CSM إلى الخلايا الدوامة. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل في ملليلتر واحد من العازلة CAS.
بعد الطرد المركزي ، نضح الطاف إلى حوالي 200 ميكرولتر. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت ل CAS إلى العينات الدوامة و aliquot خمسة ميكرولتر لعدد الخلايا. بعد طرد الخلايا واستنشاق المادة الطافية إلى 50 ميكرولتر ، أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت CAS إلى تركيز نهائي يبلغ 1 مليون خلية لكل ملليلتر وأضف حبات المعايرة لتحقيق تركيز نهائي قدره 0.1x.
قم بتحميل العينة في مقياس الكتلة الخلوية لجمع البيانات باستخدام معدل تدفق من 400 إلى 500 خلية في الثانية ، وتطبيع البيانات بعد التجميع. إذا لزم الأمر، قم بربط ملفات Flow Cytometry Standard أو FCS الفردية لكل عينة في ملف واحد. تحديد الخلايا المفردة عن طريق البوابات على الأحداث الإيجابية لإقحام الإيريديوم.
حدد الأحداث السلبية لبوابة سيسبلاتين للخلايا الحية. بوابة على السكان محل الاهتمام وتحديد النسبة النسبية للخلايا الجذعية والسلفية. لإجراء تحليل عالي الأبعاد ، قم بتصدير السكان محل الاهتمام واستخدم خوارزميات التجميع.
لتحليل X-shift ، قم بتنزيل حزمة برامج Vortex و Java 64 بت. قم بتحميل مجموعات الخلايا المصدرة إلى قاعدة بيانات محلية وحدد معلمات التجميع. لتصور العلاقات المكانية بين مجموعات الخلايا داخل مجموعات X-shift ، قم بإجراء تخطيط موجه بالقوة.
حدد تحليل CyTOF سلسلة من أربع مجموعات سكانية وخلايا جذعية ومجموعات سلفية من واحد إلى ثلاثة. تتوافق مجموعات السلف P1 و P2 مع الخلايا السلفية الأكثر نضجا بشكل متزايد. تم تحديد P3 سابقا ولكن لم يتم تمييزه بسبب وفرته المنخفضة.
تم تحليل ديناميكيات الخلايا الجذعية والسلفية بعد الإصابة باستخدام CD9 بواسطة CD104 بواسطة مخططات النقاط المحورية. لوحظت زيادة ملحوظة في عدد الخلايا الجذعية في اليوم الثالث ، مما يشير إلى التوسع. تم دعم ذلك من خلال زيادة دمج iododeoxyuridine ، مما يشير إلى تكاثر الخلايا ، وزيادة تعبير MyoD كما هو موضح في تراكب اللون.
تم تحديد الخلايا الجذعية المنشطة التي تتميز بمستويات عالية من CD98 و CD44 و MyoD و iododeoxyuridine ، مما يؤكد انتشارها العالي وحالتها النشطة في اليوم الثالث بعد الإصابة.
