للبدء ، رش جلد الماوس بنسبة 70٪ إيثانول. ثم ، باستخدام مقص تشريح معقم ، افتح الجلد وفضح عضلة الساق. قطع العضلات بجانب الساق لعرض العظم بوضوح وإزالة العظم برفق دون إتلافه.
ضع العظم على الفور في أنبوب يحتوي على 4٪ بارالدهيد ، وضع الأنبوب على الثلج. بعد جمع جميع عينات العظام ، ضع الأنابيب عند أربع درجات مئوية في غرفة باردة على شاكر مداري لمدة لا تقل عن 24 ساعة. بعد التثبيت ، استرجع الأنسجة العظمية من شاكر الحجاج واغسلها باستخدام 1X PBS مرتين لمدة ثلاث دقائق لكل منهما.
ثم استخدم مقص تشريح معقم لإزالة أي عضلة متبقية متصلة بالعظام. اغسل العظم مرة أخرى باستخدام 1X PBS لمدة ثلاث دقائق. ضع العظم في وعاء جديد يحتوي على 20٪ DDTA عند درجة الحموضة ثمانية ، واحتضن على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، استبدل محلول EDTA ب 20٪ DDTA جديد وكرر التقليب لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد المعالجة النهائية ل EDTA ، أضف EDTA طازجا واحتضن الحاوية عند أربع درجات مئوية على شاكر مداري طوال الليل. بعد ذلك ، استرجع العينات من حاوية EDTA واغسلها مرتين باستخدام 1X PBS لإزالة بقايا EDTA.
ابدأ عملية الجفاف عن طريق وضع العظم في 70٪ إيثانول واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، تخلص من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ وأضف محلول الإيثانول بنسبة 90٪. احتضان لمدة 15 دقيقة في 140 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك ، ابدأ عملية التطهير عن طريق وضع الأنسجة العظمية المجففة في وعاء جديد يحتوي على الزيلين. احتضان لمدة 20 دقيقة في 140 دورة في الدقيقة. استبدل الزيلين المستخدم بالزيلين الطازج واحتضانه لمدة 20 دقيقة أخرى.
بعد ذلك ، ضع عينة العظام التي تم تطهيرها في شريط تضمين وابدأ في تسلل الشمع. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية. تخلص من الشمع المستخدم ، وأضف شمعا جديدا ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة أخرى.
ثم استبدل الشمع واحتضانه لمدة 45 دقيقة أخرى. ضع العظم بعناية في قالب في الاتجاه المطلوب. اسمح للشمع بالتصلب على سطح بارد.
قم بتخزين الكتلة في أربع درجات مئوية حتى تقسم. بعد ذلك ، قم بإعداد المعدات للتقسيم. رش جميع أسطح العمل والأدوات بمحلول تطهير لإزالة RNases.
أيضا ، قم بإعداد حمام مائي بالماء المقطر المزدوج عند 42 درجة مئوية. نظف شفرة ميكروتوم بإيثانول 70٪ لإزالة الزيت ، ثم قم بإزالة التلوث لإزالة RNases. ثبت الشفرة على الميكروتوم وتأكد من ضبط زاوية الخلوص على 10 درجات.
رش الملقط والفرش والمجسات بمحلول تطهير وتخزينها في دلو ثلج واحد. تحضير حمام الجليد عن طريق إضافة الماء المقطر المزدوج إلى دلو ثلج آخر. ابدأ عملية التقسيم بوضع كتلة FFPE على الميكروتوم.
اضبط الميكروتوم لقص أو ضبط سمك التمرير 14 ميكرومتر. ابدأ في تقليم العينة واستمر حتى يصبح النسيج مرئيا. رطب كتلة FFPE بوضعها في حمام جليدي.
قم بتأمين العينة المائية في مشبك عينة microtome ، وقم بمحاذاتها مع الشفرة واضبط سمك التمرير على خمسة ميكرومترات. البدء في تقسيم الأنسجة. اجمع الأنسجة المجزأة باستخدام ملاقط وفرش باردة ، وضعها في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة مئوية.
ضع المنديل على شريحة زجاجية واحتضانها عند 42 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. جفف الشريحة طوال الليل في فرن في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين الشريحة المعدة في صندوق شرائح في درجة حرارة الغرفة.
باستخدام هذه الطريقة ، تم تحضير عينات عظام FFPE منزوعة المعادن من عظم الفخذ المرآة. تم تحسين الدورة الزمنية لإزالة الكلس من خلال مقارنة عظم الفخذ المتكلس مع تلك التي تم إزالة الكلس منها لمدة ثلاث و 24 ساعة. أظهر تلطيخ H و E أن وقت إزالة الكلس الأقصر أدى إلى كسور وتلف في الأقسام ، في حين أن العملية التي استغرقت 24 ساعة أسفرت عن جودة نسيجية فائقة.
كشف تقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام قيمة توزيع شظايا الحمض النووي الريبي DV200 أن العينات منزوعة الكلس حافظت على درجات DV200 أعلى من 50٪ مناسبة للتحليلات مثل SCRNAC أو Spatial Transcriptomics. ومع ذلك ، أدت أوقات الحضانة الممتدة إلى انخفاض في سلامة الحمض النووي الريبي وبالتالي لا ينصح بها.
