تم دعم هذا العمل بأموال من بيتسبرغ لعلاج الساركوما (PCS) ومعهد الساركوما العظمية (OSI).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة أدناه وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر في كلية طب الأسنان بجامعة بيتسبرغ.
1. طريقة تحضير كتل FFPE لعينات أنسجة العظام التي تتطلب إزالة المعادن
<ol><li>تحضير الكواشف والمواد<ol><li>تحضير EDTA 20٪ درجة الحموضة 8.0. بالنسبة ل 1 لتر ، قم بإذابة 200 جم من EDTA في 800 مل من الماء عالي النقاء ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم 10 N وأخيرا ارفع الحجم إلى 1 لتر بماء عالي النقاء. يحفظ في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: استخدم دائما EDTA الطازج 20٪ pH 8.0. يتم تحضير هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) 10 N عن طريق إذابة 400 جم من هيدروكسيد الصوديوم في 1 لتر من الماء عالي النقاء.</li>
		<li>تحضير بارافورمالدهايد (PFA) 4٪ في غطاء دخان باستخدام 1x PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. ملاحظة: قم بتعيين منطقة في غطاء الدخان للعمل مع محاليل بارافورمالدهايد المركزة ، أو المواد الصلبة بارافورمالدهايد ، وقم بتسميتها على هذا النحو. لتجنب التعرض ، احتفظ بالحاويات مغلقة قدر الإمكان. استخدم بأصغر الكميات العملية اللازمة للتجربة التي يتم إجراؤها. إذا كان وزن مسحوق بارافورمالدهايد وميزان الوزن لا يمكن استخدامهما في غطاء الدخان ، فاخذ أولا وعاءا ، ثم أضف مسحوق PFA في الغطاء وقم بتغطيته قبل العودة إلى الميزان لوزن المسحوق. استخدم دائما 4٪ PFA طازجة.</li>
		<li>استخدم حاوية مناسبة لكل عينة. ملاحظة: على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 1 ملغ من أنسجة العظام ، استخدم وعاءا يسمح بملامسة 1 مل على الأقل من أي محلول للعظام.</li>
		<li>تعقيم جميع المعدات الجراحية اللازمة للتشريح.</li>
		<li>نظف جميع المناطق بمحلول تطهير لإزالة RNases.</li>
		<li>اجمع المواد التجريبية المتبقية ، بما في ذلك حاويات الثلج ، ورذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ ، والوصول إلى شاكر المداري.</li>
	</ol></li>
	<li>عزل عينات الأنسجة العظمية من الفئران<ol><li>القتل الرحيم للفأر عن طريق التعرض CO2 ، ثم إجراء خلع عنق الرحم ووضعه على ظهره. رش جلد الفأر بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.</li>
		<li>باستخدام مقص تشريح معقم ، افتح الجلد وفضح عضلة الساق. اقطع العضلة بجانب الساق للحصول على رؤية واضحة لموضع العظم ، وقم بفك العظم برفق لإزالته دون ضرر. ملاحظة: ليس من الضروري إزالة كل العضلات المرتبطة بالعظم بالكامل. حاول أن تكون بأسرع ما يمكن للحد من تدهور الحمض النووي الريبي.</li>
		<li>ضع عينة العظام على الفور في أنبوب يحتوي على 4٪ PFA وضع الأنبوب على الثلج.</li>
		<li>كرر الإجراء لجمع عينات العظام الأخرى حسب الرغبة.</li>
		<li>ضع عينات تحتوي على 4٪ PFA في حالة تحريض على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل للسماح بالتثبيت المناسب.</li>
	</ol></li>
	<li>إزالة الكلمة من عينات الأنسجة العظمية<ol><li>استرجع الأنسجة العظمية من شاكر الحجاج بعد التثبيت.</li>
		<li>اغسل الأنسجة العظمية 2 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 3 دقائق على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة لإزالة أي PFA متبقي.</li>
		<li>باستخدام مقص تشريح معقم ، قم بإزالة أي عضلات متبقية لا تزال متصلة بالعظام.</li>
		<li>اغسل أنسجة العظام مرة أخرى باستخدام 1x PBS لمدة 3 دقائق.</li>
		<li>ضع النسيج العظمي في وعاء جديد يحتوي على 20٪ EDTA pH 8.0. بعد ذلك ، ضع الحاوية على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
		<li>تخلص من المحلول ، وأضف 20٪ EDTA pH 8.0 في الحاوية ، وضعه على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في RT.</li>
		<li>كرر الخطوة 1.3.6 10 مرات.</li>
		<li>تخلص من المحلول ، وأضف 20٪ EDTA pH 8.0 في الحاوية ، وضعها عند 4 درجات مئوية في غرفة باردة على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة طوال الليل.</li>
	</ol></li>
	<li>جفاف عينات أنسجة العظام<ol><li>استرجع عينة الأنسجة العظمية من الحاوية.</li>
		<li>افحص الأنسجة وتحقق من كفاءة إزالة الكلس عن طريق تدوير العظم ولفه برفق. بدلا من ذلك ، قم بإجراء أشعة سينية للعظام باستخدام جهاز الأشعة السينية. ملاحظة: إذا انثنت العينة بسهولة ، فقد تم تحقيق درجة جيدة من إزالة الكلس. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيجب زيادة معلمات إزالة الكلس (الوقت ، سرعة التحريض ، حجم 20٪ EDTA pH 8.0. المستخدمة ، إلخ).</li>
		<li>اغسل أنسجة العظام 2 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 3 دقائق لإزالة بقايا EDTA.</li>
		<li>ضع أنسجة العظام في وعاء جديد وابدأ الجفاف بنسبة 70٪ من الإيثانول. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>تخلص من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ ، وضع العينة في محلول إيثانول بنسبة 90٪ ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>تخلص من محلول الإيثانول بنسبة 90٪ ، وضع العينة في إيثانول 100٪ ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>تخلص من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وضع العينة في إيثانول جديد بنسبة 100٪ ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>تخلص من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وضع العينة في إيثانول جديد بنسبة 100٪ ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>تخلص من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وضع العينة في إيثانول جديد بنسبة 100٪ ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>تخلص من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وضع العينة في إيثانول جديد بنسبة 100٪ ، واحتضانها لمدة 45 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة. ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الجفاف باستخدام معالج تلقائي. في هذه الحالة ، قم بإعداد البرنامج بنفس الشروط التي تم الإبلاغ عنها للجفاف اليدوي. الظروف المبلغ عنها هي لعينات لا يزيد سمكها عن 4 مم (أي عينات أنسجة العظام التي تم الحصول عليها من الفئران). بالنسبة للعينات التي يزيد سمكها عن 4 مم ، يجب تحديد توقيت الجفاف تجريبيا.</li>
	</ol></li>
	<li>مسح عينات الأنسجة العظمية<ol><li>ضع عينة الأنسجة العظمية في وعاء جديد وابدأ عملية المقاصة باستخدام الزيلين. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>تخلص من الزيلين المستخدم ، وأضف زيلين جديد ، واحتضنه لمدة 20 دقيقة إضافية عند 140 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>تخلصي من الزيلين المستخدم ، وأضيفي زيلين جديد ، واحتضنيه لمدة 45 دقيقة عند 140 دورة في الدقيقة. ملاحظة: يمكن أيضا إجراء المسح باستخدام معالج تلقائي. في هذه الحالة ، قم بإعداد البرنامج بنفس الشروط التي تم الإبلاغ عنها للمسح اليدوي. الظروف المبلغ عنها هي لعينات لا يزيد سمكها عن 4 مم (أي عينات أنسجة العظام التي تم الحصول عليها من الفئران). بالنسبة للعينات التي يزيد سمكها عن 4 مم ، يجب تحديد التوقيت تجريبيا.</li>
	</ol></li>
	<li>تسلل وتضمين عينات أنسجة العظام<ol><li>استرجع عينة الأنسجة العظمية من الهزاز المداري / المعالج التلقائي بعد التطهير.</li>
		<li>ضع عينة الأنسجة العظمية في شريط تضمين وابدأ التسلل بالشمع (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 30 دقيقة على 60 درجة مئوية.</li>
		<li>تخلصي من الشمع المستخدم وأضيفي شمعا جديدا واحتضنوه لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية.</li>
		<li>تخلصي من الشمع المستخدم وأضيفي شمعا جديدا واحتضنوه لمدة 45 دقيقة عند 60 درجة مئوية.</li>
		<li>ضع بعناية عينة الأنسجة العظمية في قالب بالاتجاه المطلوب.</li>
		<li>اسمح لكتلة العينة بالتصلب على سطح بارد.</li>
		<li>قم بتخزين FFPE الذي تم الحصول عليه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا لبدء التقطيع. ملاحظة: يمكن تخزين كتلة FFPE لسنوات عديدة قبل إجراء التقسيم.</li>
	</ol></li>
</ol>2. مبادئ توجيهية لتقسيم عينات FFPE غير المنزوعة المعادن
ملاحظة: توفر الإرشادات التالية نصائح وإرشادات قيمة مفيدة لتحسين جودة أقسام الأنسجة بشكل كبير مع تجنب تدهور الحمض النووي الريبي خاصة في حالات عينات العظام الصغيرة غير المتكلسة. يمكن أيضا تطبيق هذه الإرشادات على عينات العظام منزوعة الكلس عند توفرها. بالنسبة لعينات الأنسجة العظمية الأكبر حجما ، يجب إجراء إزالة المعادن للحصول على أقسام ذات جودة أفضل ؛ في مثل هذه الحالات ، يجب اتباع الطريقة المذكورة أعلاه ، ويجب تعديل المعلمات (التوقيت ، وأحجام الحلول ، وما إلى ذلك) وفقا لذلك. الإرشادات التالية مناسبة إما عندما تتم معالجة أنسجة عظام FFPE بالفعل (على سبيل المثال ، كتلة FFPE التي تم جمعها من بنوك الأنسجة أو المختبرات الأخرى) أو عندما يتم استخدام الأقسام التي تم جمعها لإجراء أي نوع من التحليل الذي يتطلب RNA عالي الجودة أو أقسام أنسجة عالية الجودة أو كليهما.
<ol><li>إعداد المعدات<ol><li>رش جميع أسطح العمل والأدوات بمحلول تطهير لإزالة RNases.</li>
		<li>تحضير حمام مائي بالماء المقطر المزدوج وضبط درجة الحرارة على 42 درجة مئوية.</li>
		<li>خذ شفرة ميكروتوم ، ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول لإزالة بقايا الزيت ، ثم رشها بمحلول تطهير لإزالة RNases.</li>
		<li>تأمين شفرة على microtome. تأكد من ضبط زاوية الخلوص على 10 درجات. ملاحظة: استخدم دائما شفرات جديدة للتقسيم.</li>
		<li>تحضير دلاء من الجليد.</li>
		<li>احصل على ملاقط وفرش ومجسات ، ورشها بمحلول تطهير لإزالة RNases ، وضعها في أحد دلاء الثلج.</li>
		<li>قم بإعداد حمام جليدي عن طريق إضافة الماء المقطر المزدوج إلى دلو الثلج الآخر. ملاحظة: يجب ألا تطفو كتلة FFPE في الماء المضاف ؛ لذلك ، يجب أن تكون كمية الماء المضافة إلى دلو الثلج كافية للسماح للعينة بالبلل دون أن تطفو.</li>
	</ol></li>
	<li>التقسيم<ol><li>استرجع كتلة FFPE من التخزين عند 4 درجات مئوية وضعها على الميكروتوم. اضبط الأمر على Trim أو على 14 ميكرومتر من سمك التمرير ، وابدأ في قص العينة حتى يتم كشف المنديل. ملاحظة: إذا تم بالفعل قطع كتلة FFPE وكان النسيج مكشوفا بالفعل ، فتخط الخطوة 2.2.1. تحقق من أن الكتلة خالية من الثقوب والشقوق. إذا كان الأمر كذلك، فانتقل مباشرة إلى الخطوة 2.2.2. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بقص بعض الأقسام لتسطيح السطح وتجنب الثقوب والشقوق ، ثم انتقل إلى الخطوة 2.2.2.</li>
		<li>ضع كتلة FFPE على حمام الثلج لترطيب العينة. يجب تحديد وقت الترطيب تجريبيا.<ol><li>ابدأ ب 2 دقيقة وقم بزيادة الوقت إذا لم يكن الترطيب كافيا. لا تتجاوز 10 دقائق. سوف يوسع الترطيب الأنسجة ويقلل من تكوين "الستائر الفينيسية" والخطوط. يمكن أن تتسبب أوقات الترطيب الأطول في حدوث تشققات في كتلة البارافين ، وربما انفصال الأنسجة.</li>
			<li>إذا كانت 10 دقائق غير كافية لترطيب العينة ، فقم بإجراء دورات ترطيب لا تزيد عن 10 دقائق وحاول التقسيم مرة أخرى.</li>
			<li>إذا لم يكن سطح الكتلة أملسا ونظيفا بسبب الشقوق أو الجروح ، ففكر في إعادة تضمين العينة. لن تتأثر جودة الحمض النووي الريبي بعملية إعادة التضمين.</li>
		</ol></li>
		<li>ضع العينة في مشبك عينة الميكروتوم ، وقم بمحاذاتها مع الشفرة ، وابدأ في التقسيم. اضبط سمك التمرير على 5 ميكرومتر.</li>
		<li>اجمع القسم وضعه في حمام مائي على حرارة 42 درجة مئوية باستخدام ملاقط وفرش باردة. ملاحظة: بدلا من ذلك ، إذا تم إجراء عزل الحمض النووي الريبي لأقسام الأنسجة ، فقم بجمع الأقسام في أنبوب طرد مركزي واتبع مواصفات التصنيع لإعداد الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).</li>
		<li>احتضان القسم في حمام مائي لتمديد الأنسجة والقضاء على أي تجاعيد وطيات متبقية. ملاحظة: يجب تحديد وقت الطفو في حمام مائي لكل قسم تجريبيا. ضع في اعتبارك ترك أقسام العظام دقيقة إضافية في حالة حدوث مشاكل في انفصال الأنسجة. لا تترك القسم عائما لفترة طويلة لأن أوقات الطفو الطويلة قد تلحق الضرر بالأنسجة.</li>
		<li>ضع القسم على شريحة زجاجية ، ثم احتضنه لمدة 3 ساعات عند 42 درجة مئوية.</li>
		<li>ضع الشريحة الزجاجية في مجفف أو فرن طوال الليل في RT للتجفيف المناسب.</li>
		<li>قم بتخزين الشريحة الزجاجية مع القسم المرفق في RT في صندوق شرائح. ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح لسنوات عديدة في RT. إذا كان سيتم إجراء النسخ المكاني ، بدلا من شريحة زجاجية ، ضع القسم على شريحة التعبير الجيني المكاني المقدمة من الشركة المصنعة واتبع التوصيات المبلغ عنها (انظر جدول المواد).</li>
	</ol></li>
</ol>

بروتوكول لإعداد عينات أنسجة العظام FFPE منزوعة المعادن مع سلامة الحمض النووي الريبي 

<ol>
	<li>Baig, M. A., Bacha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology. Bone. , (2024).</li><li>Currey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+consequences+of+variation+in+the+mineral+content+of+bone.">The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone.</a> J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).</li><li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Undecalcified+bone+preparation+for+histology,+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis.">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707 (2010).</li><li>Wallington, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological Methods for Bone. , (1972).</li><li>Callis, G. M., Sterchi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+bone:+Literature+review+and+practical+study+of+various+decalcifying+agents.+methods,+and+their+effects+on+bone+histology.">Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology.</a> J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utilization+of+formalin+fixed-paraffin-embedded+specimens+in+high+throughput+genomic+studies.">The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies.</a> Int J Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Trinks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+clinically+relevant+features+in+single-cell+RNA+profiles+of+patient-matched+fresh+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+cancer+tissue.">Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue.</a> Cell Oncol (Dordr). , (2024).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single+nucleus+total+RNA+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues+by+snRandom-seq.">High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq.</a> Nat Commun. 14 (1), 2734 (2023).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visium+Spatial+Gene+Expression+Reagent+Kits+for+FFPE+-+User+Guide.,+Document+Number+C+CG000407+Rev+C.">Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE - User Guide., Document Number C CG000407 Rev C.</a> 10x Genomics. , (2021).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+Space+Ranger+Web+Summary+Files+for+Visium+Spatial+Gene+Expression+for+FFPE+F+FFPEAssay.,+Document+Number+CG000499+Rev+A.">Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A.</a> 10x Genomics. , (2022).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visium+Spatial+Gene+Expression+for+FFPE-Tissue+Preparation+Guide.,+Document+Number+C+G+CG000408+Rev+D.">Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D.</a> 10x Genomics. , (2022).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

هنا ، يتم توفير طريقة مفصلة لإعداد كتل FFPE من العظام منزوعة الكلس والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي للتسلسل (أي تسلسل الجيل التالي (NGS)) أو للتقنيات الأخرى المتعلقة بالحمض النووي الريبي (أي التهجين في الموقع ، تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) ، إلخ).
<p class="jove_content...

العظام هي نسيج ضام متخصص يتكون أساسا من ألياف الكولاجين من النوع 1 والأملاح غير العضوية1. نتيجة لذلك ، تكون العظام قوية وقاسية بشكل لا يصدق بينما تكون ، في نفس الوقت ، خفيفة ومقاومة للصدمات. القوة الكبيرة للعظام مستمدة من محتواها المعدني. في الواقع ، بالنسبة لأي زيادة معينة في النسبة المئوية للمحتوى المعدني ، تزداد الصلابة بمقدار خمسة أضعاف2. وبالتالي ، يواجه الباحثون مشاكل كبيرة عندما يحللون ، عن طريق التقسيم النسيجي ، بيولوجيا عينة العظام.
علم الأنسجة العظمي غير المكلس ممكن ومطلوب في بعض الأحيان ، اعتمادا على نوع التحقيق (على سبيل المثال ، لدراسة البنية الدقيقة للعظام) ؛ ومع ذلك ، فإنه يمثل تحديا كبيرا ، خاصة إذا كانت العينات كبيرة. في هذه الحالات ، تتطلب معالجة الأنسجة للأغراض النسيجية عدة تعديلات على البروتوكولات والتقنيات القياسية3. بشكل عام ، لإجراء التقييمات النسيجية الشائعة ، يتم إزالة الكلس من أنسجة العظام مباشرة بعد التثبيت ، وهي عملية قد تتطلب بضعة أيام إلى عدة أسابيع ، اعتمادا على حجم الأنسجة وعامل إزالة الكلس المستخدم4. غالبا ما تستخدم المقاطع منزوعة الكلس لفحص نخاع العظام ، وتشخيص الأورام ، إلخ. هناك ثلاثة أنواع رئيسية من عوامل إزالة الكلس: الأحماض القوية (مثل حمض النيتريك وحمض الهيدروكلوريك) والأحماض الضعيفة (مثل حمض الفورميك) وعوامل المخلب (على سبيل المثال ، حمض الإيثيلين ديامينيتريستيك أو EDTA)5. يمكن للأحماض القوية إزالة الكلس من العظام بسرعة كبيرة ، لكنها يمكن أن تلحق الضرر بالأنسجة. الأحماض الضعيفة شائعة جدا ومناسبة للإجراءات التشخيصية ؛ تعتبر العوامل المخلبية إلى حد بعيد الأكثر استخداما وملاءمة للتطبيق البحثي لأنه في هذه الحالة ، تكون عملية إزالة المعادن بطيئة ولطيفة ، مما يسمح بالاحتفاظ بالتشكل عالي الجودة والحفاظ على معلومات الجينات والبروتين ، كما هو مطلوب في العديد من الإجراءات (على سبيل المثال ، التهجين في الموقع ، التلوين المناعي). ومع ذلك ، عندما يحتاج النسخ بأكمله إلى الحفاظ عليه ، مثل تحليلات التعبير الجيني ، حتى إزالة المعادن البطيئة واللطيفة قد تكون ضارة. لذلك ، هناك حاجة إلى نهج وطرق أفضل عندما يحتاج التحليل المورفولوجي للأنسجة إلى الاقتران بتحليلات التعبير الجيني للخلايا.
بفضل التحسينات الأخيرة في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) والنسخ المكاني ، أصبح من الممكن الآن دراسة التعبير الجيني لعينة الأنسجة حتى عند استخدام تضمين البارافين لتثبيت الفورمالين (FFPE) لتخزين عينات الأنسجة6،7،8. وقد فتحت هذه الفرصة الوصول إلى عدد أكبر من العينات، مثل تلك المخزنة في بنوك المناديل الورقية في جميع أنحاء العالم. إذا كان سيتم استخدام scRNA-seq ، فإن سلامة الحمض النووي الريبي هي أهم مطلب. ومع ذلك ، في حالة النسخ المكاني لعينات FFPE ، فإن كل من أقسام الأنسجة عالية الجودة والحمض النووي الريبي عالي الجودة ضروريان لتصور التعبير الجيني في السياق النسيجي لكل قسم من الأنسجة. في حين أن هذا قد تحقق بسهولة مع الأنسجة الرخوة ، لا يمكن قول الشيء نفسه عن الأنسجة الصلبة مثل العظام. في الواقع ، على حد علمنا ، لم يتم إجراء أي دراسة باستخدام النسخ المكاني على عينات عظام FFPE. هذا بسبب عدم وجود بروتوكولات يمكنها معالجة أنسجة العظام FFPE بشكل فعال مع الحفاظ على محتوى الحمض النووي الريبي الخاص بها. هنا ، يتم توفير طريقة لمعالجة وإزالة الكلس من عينات أنسجة العظام التي تم الحصول عليها حديثا مع تجنب تدهور الحمض النووي الريبي أولا. بعد ذلك ، إدراكا للحاجة إلى تحليل النسخ لعينات FFPE التي تم جمعها في بنوك الأنسجة في جميع أنحاء العالم ، يتم أيضا تقديم إرشادات مطورة للتعامل بشكل صحيح مع عينات FFPE من العظام غير المنزوعة المعادن.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76683-470</td>
			<td>Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel Hair Brushes</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>11859</td>
			<td>Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Index Kit TS Set A 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000251</td>
			<td>Use to perform spatial transcriptomics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td>Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S312-500</td>
			<td>Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td>Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Fine Precision Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-153</td>
			<td>Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile diamond microtome blades</td>
			<td>CL Sturkey</td>
			<td>D554DD</td>
			<td>Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaseq 150PE</td>
			<td>Novogene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequencer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS&#160; to perform tissue fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premiere Tissue Floating Bath&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A84600061</td>
			<td>Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7002</td>
			<td>Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy DSP FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73604</td>
			<td>Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2245</td>
			<td>Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S8045-500</td>
			<td>Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Space Ranger</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>2.0.1</td>
			<td>Use to process sequencing data output .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Paraplast</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39601006</td>
			<td>Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000194</td>
			<td>Use to perform spatial transcriptomic experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Human Transcriptome Probe Kit Small&#160;</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000363</td>
			<td>Use to perform spatial transcriptomic experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns&#160;</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000188</td>
			<td>Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803665</td>
			<td>Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to enable spatial transcriptomics of bone tissues

يعد فهم العلاقة بين الخلايا وموقعها داخل كل نسيج أمرا بالغ الأهمية للكشف عن العمليات البيولوجية المرتبطة بالتطور الطبيعي وأمراض الأمراض. النسخ المكاني هو طريقة قوية تمكن من تحليل النسخ بالكامل داخل عينات الأنسجة ، وبالتالي توفير معلومات حول التعبير الجيني الخلوي والسياق النسيجي الذي توجد فيه الخلايا. في حين تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع للعديد من الأنسجة الرخوة ، إلا أن تطبيقها لتحليل الأنسجة الصلبة مثل العظام كان صعبا. يكمن التحدي الرئيسي في عدم القدرة على الحفاظ على الحمض النووي الريبي عالي الجودة ومورفولوجيا الأنسجة أثناء معالجة عينات الأنسجة الصلبة للتقسيم. لذلك ، يتم وصف طريقة هنا لمعالجة عينات أنسجة العظام التي تم الحصول عليها حديثا لإنشاء بيانات النسخ المكاني بشكل فعال. تسمح هذه الطريقة بإزالة الكلس من العينات ، ومنح أقسام الأنسجة الناجحة مع الحفاظ على التفاصيل المورفولوجية مع تجنب تدهور الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير إرشادات مفصلة للعينات التي كانت في السابق مدمجة في البارافين ، دون إزالة المعادن ، مثل العينات التي تم جمعها من بنوك الأنسجة. باستخدام هذه الإرشادات ، يتم عرض بيانات النسخ المكاني عالية الجودة الناتجة عن عينات بنك الأنسجة للورم الأولي وورم خبيث في الرئة من ساركوما العظام العظمية.

Bone is a specialized connective tissue comprised mainly of fibers of collagen type 1 and inorganic salts1. As a result, bone is incredibly strong and stiff while being, at the same time, light and trauma-resistant. The great strength of bone derives from its mineral content. In fact, for any given increase in the percentage of mineral content, stiffness increases by five-fold2. Consequently, investigators face significant problems when they analyze, by means of histological sectioning, the biology of a bone specimen.
Undecalcified bone histology is feasible and sometimes required, depending on the type of investigation (e.g., to study the micro-architecture of bone); it is, however, very challenging, especially if the specimens are large. In these cases, tissue processing for histological purposes requires several modifications of the standard protocols and techniques3. In general, to perform common histological evaluations, bone tissues are decalcified right after fixation, a process that may require a few days to several weeks, depending on the size of the tissue and the decalcifying agent utilized4. Decalcified sections are often used for the examination of bone marrow, the diagnosis of tumors, etc. There are three main types of decalcifying agents: strong acids (e.g., nitric acid, hydrochloric acid), weak acids (e.g., formic acid), and chelating agents (e.g., ethylenediaminetetracetic acid or EDTA)5. Strong acids can decalcify bone very rapidly, but they can damage the tissues; weak acids are very common and suitable for diagnostic procedures; chelating agents are by far the most used and appropriate for research application since, in this case, the demineralization process is slow and gentle, allowing for retention of high-quality morphology and preservation of gene and protein information, as required by many procedures (e.g., in situ hybridization, immunostaining). However, when the whole transcriptome needs to be preserved, such as for gene expression analyses, even a slow and gentle demineralization may be detrimental. Therefore, better approaches and methods are needed when the morphological analysis of the tissues needs to be paired with gene expression analyses of the cells.
Thanks to recent improvements in single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and spatial transcriptomics, it is now possible to study the gene expression of a tissue specimen even when formalin fixation paraffin embedding (FFPE) was used to store the tissue samples6,7,8. This opportunity has unlocked access to a larger number of samples, such as those stored in tissue banks worldwide. If scRNA-seq is to be employed, RNA integrity is the most important requirement; however, in the case of spatial transcriptomics of FFPE samples, both high-quality tissue sections and high-quality RNA are necessary to visualize the gene expression within the histological context of each tissue section. While this has been easily achieved with soft tissues, the same cannot be said for hard tissues like bone. In fact, to the best of our knowledge, no study using spatial transcriptomics has ever been performed on FFPE bone samples. This is because of the lack of protocols that can effectively process FFPE bone tissues while preserving their RNA content. Here, a method to process and decalcify freshly obtained bone tissue samples while avoiding RNA degradation is provided first. Then, recognizing the need for transcriptomics analysis of the FFPE samples collected in tissue banks worldwide, developed guidelines to properly handle FFPE samples of non-demineralized bones are also presented.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف الأهداف العلاجية المتقدمة في الساركوما العظمية من خلال النسخ المكاني

طرق لتمكين النسخ المكاني لأنسجة العظام

Our goal is to find better therapeutic approaches to treat a human bone cancer called osteosarcoma. In order to do so, we want to uncover the biological processes responsible for the onset of this tumor and above all for the development of its metastasis, which is deleting cause of patient's death. By employing spatial transcriptomics analysis on several matching specimens of human primary osteosarcoma line metastasis, we located in multiple patient common cell populations residing within the tumoral areas, and by comparing them, we identified several key genes which may represent valuable therapeutic targets to prevent lung metastasis.Special transcriptomics analysis of heart tissue, such as bone have been very challenging because of the inability to preserve good quality RNA and tissue morphology, while at the same time processing the heart tissue for sectioning. Our protocol addresses this gap, allowing researchers to successfully apply special transcriptomics analysis also to heart tissues.

تصف الطريقة المعروضة هنا كيفية معالجة العظام المعزولة حديثا للحصول على عينات FFPE منزوعة المعادن والتي يمكن تقسيمها بسهولة باستخدام ميكروتوم مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي (الشكل 1). تم استخدام الطريقة بنجاح على عظم الفخذ ولكن يمكن اتباعها لعينات أنسجة العظام الأخ?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring Advanced Therapeutic Targets in Osteosarcoma Through Spatial Transcriptomics at JoVE.com

هنا ، نصف طريقة تسمح بإزالة الكلس من أنسجة العظام التي تم الحصول عليها حديثا والحفاظ على الحمض النووي الريبي عالي الجودة. كما تم توضيح طريقة لتقسيم عينات الفورمالين الثابتة من البارافين (FFPE) للعظام غير المنزوعة المعادن للحصول على نتائج جيدة النوعية إذا لم تكن الأنسجة الطازجة متوفرة أو لا يمكن جمعها.

Understanding the relationship between the cells and their location within each tissue is critical to uncover the biological processes associated with ...

هدفنا هو إيجاد طرق علاجية أفضل لعلاج سرطان العظام البشري المسمى الساركوما العظمية. من أجل القيام بذلك ، نريد الكشف عن العمليات البيولوجية المسؤولة عن ظهور هذا الورم وقبل كل شيء عن تطور ورم خبيث ، وهو حذف سبب وفاة المريض. من خلال استخدام تحليل النسخ المكاني على العديد من العينات المتطابقة من ورم خبيث في خط الساركوما العظمية الأولية البشرية ، حددنا العديد من مجموعات الخلايا المشتركة للمرضى المقيمين داخل مناطق الورم ، ومن خلال مقارنتها ، حددنا العديد من الجينات الرئيسية التي قد تمثل أهدافا علاجية قيمة لمنع ورم خبيث في الرئة.كان تحليل النسخ الخاص لأنسجة القلب ، مثل العظام ، صعبا للغاية بسبب عدم القدرة على الحفاظ على الحمض النووي الريبي عالي الجودة ومورفولوجيا الأنسجة ، وفي نفس الوقت معالجة أنسجة القلب للتقسيم. يعالج بروتوكولنا هذه الفجوة ، مما يسمح للباحثين بتطبيق تحليل النسخ الخاص بنجاح أيضا على أنسجة القلب.

methods-to-enable-spatial-transcriptomics-of-bone-tissues

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Enable Spatial Transcriptomics of Bone Tissues

1.8K Views.  University of Pittsburgh School of Dental Medicine. هدفنا هو إيجاد طرق علاجية أفضل لعلاج سرطان العظام البشري المسمى الساركوما العظمية. من أجل القيام بذلك ، نريد الكشف عن العمليات البيولوجية المسؤولة عن ظهور هذا الورم وقبل كل شيء عن تطور ورم خبيث ، وهو حذف سبب وفاة المريض. من خلال استخدام تحليل النسخ المكاني على العديد من الع?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف الأهداف العلاجية المتقدمة في الساركوما العظمية من خلال النسخ المكاني

Understanding the relationship between the cells and their location within each tissue is critical to uncover the biological processes associated with normal development and disease pathology. Spatial transcriptomics is a powerful method that enables the analysis of the whole transcriptome within tissue samples, thus providing information about the cellular gene expression and the histological context in which the cells reside. While this method has been extensively utilized for many soft tissues, its application for the analyses of hard tissues such as bone has been challenging. The major challenge resides in the inability to preserve good quality RNA and tissue morphology while processing the hard tissue samples for sectioning. Therefore, a method is described here to process freshly obtained bone tissue samples to effectively generate spatial transcriptomics data. The method allows for the decalcification of the samples, granting successful tissue sections with preserved morphological details while avoiding RNA degradation. In addition, detailed guidelines are provided for samples that were previously paraffin-embedded, without demineralization, such as&#160;samples collected from tissue banks. Using these guidelines, high-quality spatial transcriptomics data generated from tissue bank samples of primary tumor and lung metastasis of bone osteosarcoma are shown.

Here, we describe a method that allows for the decalcification of freshly obtained bone tissues and the preservation of high-quality RNA. A method is also illustrated for sectioning Formalin Fixed Paraffin Embedded (FFPE) samples of non-demineralized bones to obtain good quality results if fresh tissues are not available or cannot be collected.