للبدء ، قم بتنظيف جميع مناطق الحاضنة والمضخة التمعجية تماما بمطهر لضمان بيئة شبه معقمة. ثم اغسل كل أنبوب ب 700 ميكرولتر من PBS مع المغنيسيوم والكالسيوم ، متبوعا ب 500 ميكرولتر من C2 أو وسط مكيف EC. استخدم الأنبوب بمسافة قصيرة من قفل الإغراء إلى سدادة المضخة التمعجية للتجويف الأيسر والأنبوب مع التماثل الآخر للتجويف الأيمن.
بعد استرداد الرقاقة الحيوية بخلايا HUVEC و C2BBe1 من الحاضنة ، قم بإجراء تبادل متوسط مع 350 ميكرولتر لكل غرفة. ثم انقل المقابس من الموقع السفلي إلى الموقع العلوي. أضف 350 ميكرولترا من الوسائط الطازجة إلى الغرفة السفلية للرقاقة الحيوية.
بعد ذلك ، قم بإزالة جميع المقابس واملأ جميع المنافذ إلى الأعلى. بدءا من التجويف الأيسر ، أدخل محول قفل الإغراء في منفذ الرقاقة الحيوية لتوصيل الأنبوب الأول بالمنفذ الأيمن للغرفة العلوية. ثم قم بتوصيل الأنبوب الثاني بالمنفذ الأيسر للغرفة السفلية.
بعد ذلك ، خذ خزانا وأضف قطرة صغيرة من وسط زراعة الخلايا إلى قاع الخزان. ثم أدخل الخزان على الجانب الآخر من الأنبوب الأول وكرر للغرفة الأخرى. بمجرد توصيل جميع المنافذ بأنبوب أو خزان ، املأ الخزانات ب 3.5 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا.
ثم ضع الجانب السائب من الأنبوب ، الذي يحتوي على غطاء متصل به ، في الجزء العلوي من الخزان لإغلاق نظام الموائع الدقيقة لكل غرفة. نقل الرقاقة الحيوية إلى المضخة التمعجية. باستخدام سدادات المضخة التمعجية ، قم بتوصيل كل أنبوب بالمضخة التمعجية بحيث يتدفق الوسط من الخزان إلى التجويف والعودة عبر المضخة.
ثم قم بلف كل غرفة بمعدل تدفق 50 ميكرولتر في الدقيقة. بمجرد اكتمال الوفرة المسبقة ، أوقف المضخة التمعجية. قم بإزالة الغطاء المتصل بأنبوب كل خزان وضعه على منديل معقم بجوار المضخة.
بعد إزالة كل الوسط ، املأ الخزانات ب 2 ملليلتر من الوسط الطازج. أعد توصيل الأنبوب والغطاء واستمر في التروية الدائرية بمعدل تدفق 50 ميكرولتر في الدقيقة لمدة 24 ساعة إضافية. بمجرد إيقاف المضخة التمعجية ، افتح خزانات جميع التجاويف.
أفرغ الخزانات وافصل الأنابيب والخزانات عن الرقاقة الحيوية. اغسل تجاويف الموائع الدقيقة ب 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد مع المغنيسيوم والكالسيوم مرتين لكل غرفة. أضف 500 ميكرولتر من الميثانول البارد المثلج إلى جميع التجاويف.
بعد فتح الشريحة ، قم بقص أو إزالة رقائق الترابط للرقاقة الحيوية. قطع الأنسجة التي تحتوي على غشاء PET إلى النصف لتلطيخها بالتوازي مع الألواح المناعية المختلفة. باستخدام ملاقط دقيقة ، انقل كل قطعة غشاء إلى بئر منفصل في صفيحة 24 بئرا بمحلول مانع ونفاذ.
ثم انقل قطع الغشاء إلى شريحة زجاجية نظيفة داخل غرفة رطبة. أضف 50 ميكرولترا من الأجسام المضادة الأولية المحضرة ومحلول التلوين لكل قطعة غشاء. بمجرد نقل العينات إلى صفيحة 24 بئرا ، اغسل الأغشية مرتين لمدة 5 دقائق بمحلول غسيل ، ثم باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على المغنيسيوم والكالسيوم.
باستخدام وسيط تثبيت مضان وغطاء زجاجي ، قم بتركيب قطع الغشاء على شريحة زجاجية نظيفة وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى التصوير المجهري. بعد خمسة أيام من الوفرة ، أظهر الحمض النووي النووي الملطخ ب DAPI بلاعم مشتقة من الخلايا الوحيدة متمايزة تماما تعبر عن CD68 تنتشر في جميع أنحاء الأنسجة الوعائية. خلقت HUVECs طبقة متقاربة تظهر سلامة الأنسجة من خلال تشكيل تقاطعات الالتصاق ، مثل VE-cadherin.
بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن عامل فون ويلبراند بشكل كبير من قبل HUVECs. بعد خمسة أيام من الوفرة ، شكلت خلايا C2BBe1 طبقات خلايا ظهارية مستقطبة تعبر عن بروتينات الوصلة E-cadherin و ZO-1. يمكن الكشف عن النمو ثلاثي الأبعاد للهياكل الشبيهة بالزغب والشبيهة بالقبو للظهارة في القسمين x و y من مكدس Z بعد ستة أيام من التروية.
