الحقن المجهري لأجنة ذبابة الفاكهة لجين التحوير الجنيني بوساطة phiC31 Integrase

للبدء ، باستخدام فرشاة الرسم ، انقل أجنة ذبابة الفاكهة منزوعة الكلور إلى شريط طويل من أجار العنب. استخدم إبرة تشريح لتبطين حوالي 60 جنينا على طول حافة الشريط بحيث تكون مؤخرتها متجهة للخارج. الآن ضع شريطا على الوجهين بطول 18 ملم بالطول على طول حافة انزلاق الغطاء.

بعد إزالة الدعم ، اضغط برفق على انزلاق الغطاء على الأجنة المحاذية ، وانقل قسيمة الغطاء مع الأجنة إلى صندوق يحتوي على مجفف. أضف زيت الكربون هالة فوقها. لحقن الأجنة الدقيقة ، قم أولا بتحميل ميكرولتر من الحمض النووي في إبرة باستخدام ماصة ممتدة.

ضع الأجنة المحاذية بزيت الكربون هالة تحت المجهر المقلوب. بعد ذلك ، استخدم مناولة دقيقة لإدخال الإبرة في الأطراف الخلفية للجنين. مع التحكم في القدم ، قم بحقن الحمض النووي بعناية في الجنين.

قم بإزالة الإبرة بعد الانتهاء من الحقن المجهري للجنين الأول ، ثم انقلها إلى النهاية الخلفية للجنين التالي. نقل الأجنة المحقونة إلى صفيحة أجار للحضانة. عندما يفقس البيض ، قم بإعداد قارورة مع الطعام.

أضف بضع قطرات من الماء المقطر إلى القارورة. باستخدام مجهر ستيريو وفرشاة رسم ، اجمع اليرقات المفرغة ، ثم انقلها إلى القارورة. احتضان القارورة عند 25 درجة مئوية تحت رطوبة 50٪ إلى 60٪ لمدة 10 أيام.

تظهر الأجنة الجافة بشكل مفرط مشوهة ولا يمكن استخدامها للحقن المجهري. تسربت الأجنة غير المجففة كمية كبيرة من السيتوبلازم عند ثقبها ، مما يقلل من معدلات البقاء على قيد الحياة. تسربت الأجنة المجففة بشكل مناسب فقط حجم صغير ، إن وجد ، عند حقنها.

كان لخط ذبابة الفاكهة الذي يعبر عن إنزيم phiC31 integrase المستخدم في الحقن المجهري للجنين عيون بيضاء. الذباب المسن من هذا النمط الوراثي له عيون وردية ناتجة عن بروتين الفلورسنت الأحمر المتراكم المعبر عنه على وجه التحديد في العين. تم إنتاج الذباب المعدل وراثيا الذي يحمل جين التحوير في موقع الالتحام attP2 بعيون برتقالية بنجاح.