للبدء ، أضف 1.5 ملليلتر من 70٪ إيثانول إلى 30 ملليغرام من جزيئات التنغستن 0.7 ميكرومتر في أنبوب صغير. الطرد المركزي الخليط في 13 ، 200G لمدة 15 دقيقة. أضف 1.5 ملليلتر من الماء المعقم إلى الجسيمات ، ثم الدوامة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 500 ميكرولتر من الجلسرين المعقم بنسبة 50٪ إلى جزيئات التنغستن. لتغليف الجسيمات ، أضف أولا خمسة ميكروجرامات من بلازميد 2 ميكرون و 15 ميكروجرام من بلازميد بكتيري يحتوي على تسلسل الميتوكوندريا في أنبوب دقيق يوضع على الجليد. أضف 100 ميكرولتر من تعليق جسيمات التنغستن إلى الأنبوب والدوامة.
ثم أضف أربعة ميكرولتر من السبيرميدين والمولي الواحد والدوامة مرة أخرى. الآن ماصة 100 ميكرولتر من الجليد البارد 2.5 مولار كلوريد الكالسيوم في الأنبوب. بعد دوامة التعليق لفترة وجيزة ، احتضانه على الجليد لمدة 10 دقائق.
أجهزة الطرد المركزي جزيئات التنغستن في 13،200G لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الجسيمات في 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أخيرا ، أعد تعليق جزيئات التنغستن في 60 إلى 70 ميكرولترا من درجة حرارة الغرفة 100٪ إيثانول.
لتحضير المواد البيولوجية ، ضع ستة حوامل كبيرة معقمة على صفيحة زجاجية معقمة. استخدم زوجا من الملقط المعقم لإدخال الناقلات الكبيرة في كل حامل من حاملات الناقلات الكبيرة الستة. ماصة 10 ميكرولتر من جزيئات التنغستن المشفرة بالحمض النووي على كل سطح ناقل كبير وتوزيعها بالتساوي على السطح بأكمله باستخدام طرف الماصة.
تلقيح سلالة مستقبلات الخميرة رو صفر في ملليلتر من وسط YPR. تنمو الثقافة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية في عجلة دوارة. في اليوم التالي ، انقل 300 ميكرولتر من الثقافة إلى أنبوب يحتوي على 30 ملليلتر من وسط YPR الطازج.
ضع الثقافة على شاكر دوار لمدة ليلتين عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة حتى تشبع الثقافة. أجهزة الطرد المركزي خلايا الخميرة في 600G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في 600 ميكرولتر من وسط YPD بعد التخلص من المادة الطافية.
الآن استخدم مقبض زجاجي معقم لنشر 100 ميكرولتر من تعليق خلية الخميرة على لوحة متوسطة للقصف الصلبة. بعد نشر جميع الثقافات ، احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات قبل القصف.
