للبدء ، باستخدام ماصة ، حدد خمسة ميكرولترات من كل مستخلص على بعد سنتيمترين على النقاط المحددة على الخط السفلي للوحة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ، أو TLC. اترك البقع تجف على لوحة TLC وكرر حتى يتم تحميل حوالي خمسة ملليغرام من كل مستخلص على اللوحة. تحضير محلول 1: 2 من ثنائي كلورو الميثان والميثانول في خزان تطوير TLC.
ضع لوحة TLC في الخزان النامي وقم بتطويرها ، حتى يصل المذيب إلى الخط المحدد بسنتيمترين من أعلى اللوحة. بمجرد التطوير ، قم بإزالة لوحة TLC من الخزان. على الفور ، حدد عناصر التحكم الإيجابية على النقاط فوق خط المذيب.
ضع اللوحة في صندوق لوحة TLC معقم بالإيثانول قبل أن يتبخر كل المذيب. كشط حصيرة mycelial من لوحات مسببات الأمراض الخمسة باستخدام ملعقة معدنية معقمة. ثم قم بنقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر.
بعد إضافة 25 ملليلتر من مرق دكستروز البطاطس المعدل بأجار ، أضف حبات زجاجية معقمة إلى الأنبوب ، ودوامة لمدة خمس دقائق لتفتيت حصيرة الفطريات. بعد تجميع بخاخ الكروماتوغرافيا في غطاء المحرك ، قم بتوصيل الأنبوب. ثم قم بتوصيل مقياس التدفق بالإعداد.
انقل المعلق الفطري إلى بخاخ الكروماتوغرافيا باستخدام حقنة معقمة بطرف إبرة لضمان عدم انسداد قطع كبيرة من الفطريات البخاخ. ضع ألواح TLC المطورة مسبقا على مناشف ورقية معقمة في غطاء التدفق الصفحي لتقليل ملامسة اليد للوحة ، أثناء تطبيق تعليق الوسائط. قم بتوصيل عينة العامل الممرض بالبخاخ المجمع وقم بتطبيق ثلاث طبقات من التعليق على لوحة TLC ، مما يسمح للوحة بالجفاف تماما بين التطبيقات.
بعد ذلك ، قم بإعداد إعداد الحضانة بإضافة 50 مل من الماء المعقم إلى صندوق ألواح بلاستيكية معقمة. ضع أربع لوحات بتري فيه لتجلس عليه لوحة TLC. أيضا ، ضع صفائح السليلوز المطوية المعقمة أو ورق الترشيح على كل جانب من الصندوق للاحتفاظ بالرطوبة.
ضع لوحة الفحص المكتملة على أربعة أطباق بتري فارغة في الصندوق. احتضان الفحص لمدة ثلاثة أيام إلى أسبوع واحد أو حتى تنمو طبقة متساوية من الفطريات عبر اللوحة ، باستثناء حول الضوابط الإيجابية ومنطقة التثبيط. ثم ، باستخدام ملعقة معدنية ، اكشط السيليكا من مناطق التثبيط وضعها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
أضف 500 ميكرولتر من الميثانول إلى كل أنبوب ودوامة لاستخراج المستقلبات من السيليكا. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لحبيبات السيليكا ونقل المادة الطافية إلى قوارير كروماتوغرافية سائلة للتحليل. أظهر التصوير تحت الأشعة فوق البنفسجية فصل المستقلبات على لوحة TLC.
بعد الحضانة ، بدا أن العامل الممرض ينمو بالتساوي عبر اللوحة بأكملها ، باستثناء الضوابط الإيجابية ومناطق التثبيط.
