نحن نقدر بامتنان الزراعة والأغذية الزراعية الكندية للتمويل الذي أصبح بموجبه هذا البحث ممكنا (المشروعان J-001843 و J-002021). نشكر بريت فان هاينينجن على تصوير محتوى الفيديو لهذا البروتوكول. نود أيضا أن نشكر طلاب الدراسات العليا السابقين (جينيفر فاكون ومارك نابور) على رؤيتهم حول الأساليب الموضحة في هذه المخطوطة.

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.
1. اختيار مرشحي المكافحة الحيوية الميكروبية
<ol><li>باستخدام مقايسات لوحة المنافسة ، حدد العزلات الميكروبية التي تظهر العداء ضد العامل الممرض محل الاهتمام. ملاحظة: تم اختيار تسع عزلات عصوية أظهرت عداء ضد S. sclerotiorum ، بما في ذلك أنواع Bacillus atrophaeus و mojavensis و subtilis ، لإثبات هذا البروتوكول.</li>
</ol>2. إعداد وسائل الإعلام
<ol><li>تحضير أجار سكر العنب البطاطا (PDA) عن طريق إذابة 39 غرام من الوسط لكل لتر من الماء.</li>
	<li>تحضير Pseudomonas F agar بإضافة 45 غرام من الوسائط لكل لتر من الماء.</li>
	<li>تحضير مرق سكر العنب البطاطا (PDB) مع 1 ٪ أجار عن طريق إضافة 24 غرام من المتوسطة ، و 0.24 غرام أجار لكل لتر من الماء.</li>
	<li>تحضير مرق الخميرة والجلوكوز والمنغنيز (YGM). قم بإنشاء محلول عازل يتكون من 2.5 جم من KH2PO4 و 2.5 جم K2HPO4 في 100 مل من الماء ، ومحلول ملح يتكون من 0.58 جم من MnSO4. H20 ، 0.5 جم من كلوريد الصوديوم و 0.05 جم من FeSO 4.7H20 في 100 مل من الماء.<ol><li>بعد ذلك ، أضف 1 جم من مستخلص الخميرة ، و 1.25 جم من سكر العنب ، و 400 مل من الماء ، و 5 مل من المحلول العازل ، و 5 مل من محلول الملح ، و 90 مل من الماء لضمان عدم ترسب الأملاح المعدنية في المحلول.</li>
	</ol></li>
	<li>تعقيم الأوتوكلاف الوسائط ، صب أجار في لوحات بتري 100 × 15 مم ، واترك كل شيء يبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.</li>
</ol>3. إعداد مسببات الأمراض
<ol><li>استزرع خمس أطباق من Sclerotinia sclerotiorum على القناة الشريانية السالكة (محضرة في الخطوة 2.1) واحتضانها عند 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام.</li>
</ol>4. إعداد استخراج المنتج الطبيعي
<ol><li>استزرع كل عزل بكتيري على Pseudomonas F Agar (محضر في الخطوة 2.2) وينمو حتى يتم ملاحظة المستعمرات الفردية.</li>
	<li>استزراع فرعي مستعمرات بكتيرية مفردة في 25 مل من وسائط YGM في أجهزة طرد مركزي أو أنابيب استزراع واحتضانها مع الهز لمدة 3 أيام.</li>
	<li>نقل 5 مل من القسمة من كل مستخلص إلى 1 لتر من YGM واحتضانها في نفس الظروف لمدة 3 أيام أخرى.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي كل ثقافة في 3000 × غرام لمدة 15 دقيقة في 25 درجة مئوية لبيليه الخلايا.</li>
	<li>صب وغسل المادة الطافية ثلاث مرات مع خلات الإيثيل لاستخراج المستقلبات من وسط الاستزراع.</li>
	<li>الجمع بين وتجفيف طبقة خلات الإيثيل من كل منها باستخدام التبخر الدوار.</li>
	<li>أعد إذابة المستخلص في الحد الأدنى من الميثانول ، وانقله إلى قارورة تلألؤ صغيرة ، وجففه مرة أخرى عن طريق التبخر الدوار. ملاحظة: إذا جف المستخلص إلى مادة زيتية أو راتنجية ، فقم بتجفيف المادة بالتجميد للحصول على مسحوق جاف يمكن وزنه بدقة.</li>
</ol>5. إعداد لوحة TLC
<ol><li>قم بإعداد لوحة TLC مقاس 20 سم × 20 سم عن طريق رسم خط 2 سم من الأسفل و 2 سم من أعلى اللوحة. في المحصلة النهائية ، ضع تسع نقاط على بعد 2 سم. فوق الخط العلوي ، ضع أربع نقاط على بعد 4 سم.</li>
	<li>قم بإذابة 5 ملغ من كل مستخلص في 15 ميكرولتر من الميثانول وتطبيق 5 ميكرولتر من كل مستخلص على النقاط التسع المحددة على الخط السفلي باستخدام ماصة. اترك كل بقعة مستخلص تجف على لوحة TLC وقم بتطبيق 5 ميكرولتر أخرى على نفس المكان. كرر حتى يتم تحميل جميع المواد على لوحة TLC.</li>
	<li>قم بتطوير لوحة TLC في خزان نام باستخدام محلول 1: 2 من ثنائي كلورو الميثان والميثانول حتى يصل المذيب إلى الخط المحدد 2 سم من أعلى اللوحة (حوالي 45 دقيقة).</li>
	<li>بمجرد التطوير ، قم بإزالة لوحة TLC وقم بتطبيق سلسلة من عناصر التحكم الإيجابية على النقاط الأربع المحددة فوق خط المذيب. يتم استخدام أربعة تركيزات من نفس التحكم. بالنسبة ل S. scl. ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 5 ميكروغرام / مل ، 50 ميكروغرام / مل ، و 500 ميكروغرام / مل من Hygromycin B هي ضوابط إيجابية.</li>
	<li>قبل أن يتبخر كل المذيب من اللوحة ، ضعه في صندوق لوحة TLC معقم بالإيثانول.</li>
</ol>6. مقايسة السيرة الذاتية المباشرة
<ol><li>الأوتوكلاف المواد التي سيتم استخدامها في الفحص (المكونات الزجاجية لبخاخ الكروماتوغرافيا ، ملعقة معدنية ، أربع أوراق من منشفة ورقية ، السليلوز أو ورق الترشيح ، الماء ، والوسائط) في دورق كبير مغطى بورق القصدير. ملاحظة: يجب لف المواد الورقية (منشفة ورقية ، ورق السليلوز) بورق القصدير لتجنب البلل في الأوتوكلاف.</li>
	<li>قم بتوصيل مصدر الهواء ومقياس الضغط وبخاخ الكروماتوغرافيا باستخدام أنابيب PTFE المعقمة بالإيثانول. قم بتوصيل مرشح HEPA بين بخاخ الكروماتوغرافيا ومقياس الضغط.</li>
	<li>اجمع حصيرة الفطريات لألواح مسببات الأمراض الخمسة باستخدام الملعقة المعدنية المعقمة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام ملعقة معقمة. ملاحظة: استخدم كمية صغيرة من المرق السائل للمساعدة في إزاحة الفطريات إذا لزم الأمر ، وانقلها باستخدام ماصة معقمة.</li>
	<li>أضف 25 مل من PDB المعدل بأجار وخرز زجاجي معقم إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل والدوامة لمدة 5 دقائق لتفتيت حصيرة الفطريات.</li>
	<li>انقل المعلق الفطري إلى بخاخ كروماتوغرافي باستخدام حقنة معقمة بطرف إبرة لضمان عدم انسداد قطع كبيرة من الفطريات بخاخ الكروماتوغرافيا.</li>
	<li>ضع ألواح TLC المطورة مسبقا على مناشف ورقية معقمة في غطاء تدفق رقائقي لتقليل ملامسة اليد للوحة أثناء تطبيق تعليق الوسائط.</li>
	<li>قم بزيادة ضغط الهواء إلى حوالي 4 بار وقم بتطبيق ثلاث طبقات من التعليق على لوحة TLC ، مما يسمح للوحة بالجفاف تماما بين التطبيقات. ملاحظة: تم العثور على ثلاث طبقات لتكون الكمية المثلى. أقل من هذا ، وليس لدى العامل الممرض وسائط كافية للنمو. أكثر من ذلك ، فإن الوسائط سميكة للغاية ، مما قد لا يسمح باتصال مسببات الأمراض مع المستقلبات النشطة.</li>
	<li>أضف 500 مل من الماء المعقم إلى صندوق أطباق بلاستيكي معقم وضع صفائح السليلوز المطوية المعقمة أو ورق الترشيح على كل جانب للاحتفاظ بالرطوبة.</li>
	<li>ضع لوحة الفحص المكتملة على أربعة أطباق بتري فارغة في الصندوق.</li>
	<li>احتضان الفحص لمدة 3 أيام إلى 1 أسبوع أو حتى تنمو طبقة متساوية من الفطريات بالتساوي عبر لوحة TLC باستثناء حول الضوابط الإيجابية ومنطقة التثبيط (ZOIs).</li>
</ol>7. تحليل مطياف الكتلة اللوني السائل
<ol><li>قم بتصوير الفحص المكتمل باستخدام التصوير الفوتوغرافي.</li>
	<li>احسب عامل الاحتفاظ لكل منطقة تثبيط بقسمة المسافة من الحد الأدنى إلى ZOI على المسافة من الحد الأدنى إلى الخط العلوي.</li>
	<li>كشط السيليكا من مناطق التثبيط ووضعها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.</li>
	<li>أضف 500 ميكرولتر من الميثانول إلى كل أنبوب ودوامة لاستخراج المستقلبات من السيليكا.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 8500 × جم عند 20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ونقل المادة الطافية إلى قنينة صغيرة.</li>
	<li>تتبخر حتى تجف عن طريق التبخر الدوار أو تحت تيار من النيتروجين.</li>
	<li>أعد تعليق المستخلص في 50 ميكرولتر من الميثانول في قنينة LC.</li>
	<li>تحليل المستقلبات في منطقة التثبيط بواسطة LC-MS ومقارنتها بالمستقلبات في المستخلص الخام لتحديد المستقلبات الموجودة في المستخلص الخام المسؤولة عن تثبيط العامل الممرض16.</li>
	<li>باستخدام جنس وأنواع الكائنات الحية الدقيقة المصدر والكتل المحددة في ZOI ، ابحث في الأدبيات وقواعد البيانات ذات الصلة مثل Antibase وقاموس المنتجات الطبيعية لتحديد المستقلبات.</li>
</ol>

استخدام مقايسة التصوير الحيوي المباشر TLC لتحديد المنتجات الطبيعية للمكافحة الحيوية

<ol>
	<li>Fisher, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+fungal+threats+to+animal,+plant+and+ecosystem+health.">Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health.</a> Nature. 484 (7393), 186-194 (2012).</li><li>Savary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+pathogens+and+pests+on+major+food+crops.">The global burden of pathogens and pests on major food crops.</a> Nat Ecol Evol. 3 (3), 430-439 (2019).</li><li>Lin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilience+in+agriculture+through+crop+diversification:+Adaptive+management+for+environmental+change.">Resilience in agriculture through crop diversification: Adaptive management for environmental change.</a> BioSci. 61 (3), 183-193 (2011).</li><li>Piquerez, S. J., Harvey, S. E., Beynon, J. L., Ntoukakis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+crop+disease+resistance:+Lessons+from+research+on+arabidopsis+and+tomato.">Improving crop disease resistance: Lessons from research on arabidopsis and tomato.</a> Front Plant Sci. 5, 671 (2014).</li><li>Damalas, C., Koutroubas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+recent+developments+in+biopesticide+use.">Current status and recent developments in biopesticide use.</a> Agriculture. 8 (1), 13 (2018).</li><li>Syed Ab Rahman, S. F., Singh, E., Pieterse, C. M. J., Schenk, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+microbial+biocontrol+strategies+for+plant+pathogens.">Emerging microbial biocontrol strategies for plant pathogens.</a> Plant Sci. 267, 102-111 (2018).</li><li>Tudi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+routes+and+health+risks+associated+with+pesticide+application.">Exposure routes and health risks associated with pesticide application.</a> Toxics. 10 (6), 335 (2022).</li><li>Santos, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+thuringiensis:+From+biopesticides+to+anticancer+agents.">Bacillus thuringiensis: From biopesticides to anticancer agents.</a> Biochimie. 192, 83-90 (2022).</li><li>Kumar, J., Ramlal, A., Mallick, D., Mishra, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+some+biopesticides+and+their+importance+in+plant+protection+for+commercial+acceptance.">An overview of some biopesticides and their importance in plant protection for commercial acceptance.</a> Plants. 10 (6), 1185 (2021).</li><li>Marrone, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pesticidal+natural+products+-+status+and+future+potential.">Pesticidal natural products - status and future potential.</a> Pest Manag Sci. 75 (9), 2325-2340 (2019).</li><li>Ayilara, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopesticides+as+a+promising+alternative+to+synthetic+pesticides:+A+case+for+microbial+pesticides,+phytopesticides,+and+nanobiopesticides.">Biopesticides as a promising alternative to synthetic pesticides: A case for microbial pesticides, phytopesticides, and nanobiopesticides.</a> Front. Microbiol. 14, 1040901 (2023).</li><li>Abdelaziz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocontrol+of+soil+borne+diseases+by+plant+growth+promoting+rhizobacteria.">Biocontrol of soil borne diseases by plant growth promoting rhizobacteria.</a> Trop. Plant Pathol. 48 (2), 105-127 (2023).</li><li>Zhao, Z., Liu, D., Ruan, L., Wang, T., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+mechanism+of+Bacillus+amyloliquefaciens+SC-B15+and+its+application+in+cereal+mildewproof+and+grape+preservation.">Antifungal mechanism of Bacillus amyloliquefaciens SC-B15 and its application in cereal mildewproof and grape preservation.</a> Food Biosci. 56, 103287 (2023).</li><li>Jamshidi-Aidji, M., Dimkic, I., Ristivojevic, P., Stankovic, S., Morlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect-directed+screening+of+bacillus+lipopeptide+extracts+via+hyphenated+high-performance+thin-layer+chromatography.">Effect-directed screening of bacillus lipopeptide extracts via hyphenated high-performance thin-layer chromatography.</a> J Chromatogr A. 1605, 460366 (2019).</li><li>Prichystal, J., Schug, K. A., Lemr, K., Novak, J., Havlicek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+natural+products.">Structural analysis of natural products.</a> Anal Chem. 88 (21), 10338-10346 (2016).</li><li>De Souza, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+lipopeptide+isoforms+by+UPLC-MS+in+the+fermentation+broth+from+Bacillus+subtilis+CNPMS22.">Simultaneous quantification of lipopeptide isoforms by UPLC-MS in the fermentation broth from Bacillus subtilis CNPMS22.</a> Anal Bioanal Chem. 410 (26), 6827-6836 (2018).</li><li>Dewanjee, S., Gangopadhyay, M., Bhattacharya, N., Khanra, R., Dua, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioautography+and+its+scope+in+the+field+of+natural+product+chemistry.">Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry.</a> J Pharm Anal. 5 (2), 75-84 (2015).</li><li>Choma, I., Jesionek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLC-direct+bioautography+as+a+high+throughput+method+for+detection+of+antimicrobials+in+plants.">TLC-direct bioautography as a high throughput method for detection of antimicrobials in plants.</a> Chromatography. 2 (2), 225-238 (2015).</li><li>Attia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography-bioautographic+method+for+the+detection+of+arginase+inhibitors.">Thin-layer chromatography-bioautographic method for the detection of arginase inhibitors.</a> J Sep Sci. 43 (12), 2477-2486 (2020).</li><li>Legerska, B., Chmelova, D., Ondrejovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLC-bioautography+as+a+fast+and+cheap+screening+method+for+the+detection+of+alpha-chymotrypsin+inhibitors+in+crude+plant+extracts.">TLC-bioautography as a fast and cheap screening method for the detection of alpha-chymotrypsin inhibitors in crude plant extracts.</a> J Biotechnol. 313, 11-17 (2020).</li><li>Agatonovic-Kustrin, S., Doyle, E., Gegechkori, V., Morton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+thin-layer+chromatography+linked+with+(bio)assays+and+FTIR-ATR+spectroscopy+as+a+method+for+discovery+and+quantification+of+bioactive+components+in+native+Australian+plants.">High-performance thin-layer chromatography linked with (bio)assays and FTIR-ATR spectroscopy as a method for discovery and quantification of bioactive components in native Australian plants.</a> J Pharm Biomed Anal. 184, 113208 (2020).</li><li>Hilaire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+screening+anti-leishmania+compounds+in+plants+extracts+by+HPTLC-bioautography.">New method for screening anti-leishmania compounds in plants extracts by HPTLC-bioautography.</a> J Chromatogr B. 1188, 123061 (2022).</li><li>Stankovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPTLC-direct+bioautography-guided+isolation+of+isogeranic+acid+as+the+main+antibacterial+constituent+of+Artemisia+santonicum+essential+oil.">HPTLC-direct bioautography-guided isolation of isogeranic acid as the main antibacterial constituent of Artemisia santonicum essential oil.</a> J Serb Chem Soc. 84 (12), 1355-1365 (2019).</li><li>Su, Y., Qi, Y., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+sporulation+in+plant+pathogenic+fungi.">Induction of sporulation in plant pathogenic fungi.</a> Mycology. 3, 195-200 (2012).</li><li>Wedge, E., Nagle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+2D-TLC+bioautography+method+for+the+discovery+of+novel+antifungal+agents+to+control+plant+pathogens.">A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens.</a> J Nat Prod. 63, 1050-1054 (2000).</li></ol>

توفيت الدكتورة سوزان بويتشكو قبل تقديم هذا العمل (8 فبراير 2023). أعلن جميع المؤلفين الآخرين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

TLC-DB هي أداة بحث NP قيمة وراسخة وبديل بسيط وغير مكلف لطرق العزل الموجهة بالمقايسة الحيوية للصفائح الدقيقة17. يتطلب الحد الأدنى من الوقت والموارد المادية مقارنة بمقايسات الصفائح الدقيقة ، والتي تتطلب فصل الأيض باستخدام تقنيات الكروماتوغرافيا السائلة. إنه اختبار متعدد الاستخدامات للغاية يمكن استخدامه للكشف عن NPs المضادة للبكتيريا والفطريات والطفيليات ومضادات الأكسدة بالإضافة إلى مثبطات الإنزيم18،19،20،21،22،23. على الرغم من أنها الأكثر استخداما للكشف عن المواد الكيميائية النباتية النشطة بيولوجيا وتحديدها ، إلا أنه يمكن تطبيق نفس الطريقة على NPs البكتيرية كما هو موضح في هذا البروتوكول18. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحسين البروتوكول للاستخدام مع مجموعة متنوعة من مصادر NP ومسببات الأمراض المستهدفة للمساعدة في اكتشاف وتقييم NPs النشطة بيولوجيا الجديدة.
يمكن أن تؤثر الوسائط المستخدمة لنمو البكتيريا والمذيبات المستخدمة في الاستخراج بشكل كبير على نتائج اكتشاف المنتجات الطبيعية. تم تحسين الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول للبكتيريا التي تنتج الببتيدات الشحمية الحلقية ، بما في ذلك Pseudomonas و Bacillus spp. ولكن ينبغي النظر في وسائل الإعلام ومصادر المغذيات الأخرى عند استكشاف أجناس أخرى. يمكن للمرء أن يختار إكمال TLC-DB باستخدام نفس الكائنات الحية الدقيقة المزروعة في مجموعة من الوسائط لتقييم النطاق الكامل لتنوع الأيض من عزلة واحدة أو استخدام ظروف نمو متطابقة لمجموعة واسعة من العزلات. يؤثر اختيار مذيب الاستخراج أيضا على المنتجات الطبيعية المكتشفة. من المفهوم عموما أن معظم NPs النشطة بيولوجيا لها قطبية منخفضة إلى معتدلة ، مما يجعل أسيتات الإيثيل خيارا مناسبا بسبب نقطة غليانها المنخفضة ، مما يجعل من السهل إزالتها. ومع ذلك ، إذا رغب المرء أيضا في فحص الكسور القطبية وغير القطبية ، فيمكن إجراء عمليات استخراج متعددة بمذيبات أخرى. بدلا من ذلك ، يمكن تجفيف المستخلص الخالي من الخلايا بالتجميد واستخدامه في الفحص لرؤية جميع المستقلبات التي يتم إطلاقها في الوسائط. ومع ذلك ، غالبا ما يلزم تحميل المزيد من المواد على لوحة TLC لحساب مكونات الوسائط المجففة في المادة المجففة بالتجميد. وبالمثل ، إذا تم استخدام هذه الطريقة مع مسببات الأمراض المختلفة ، مثل اللقاح ، فيجب تحسين الوسائط المستخدمة وظروف الحضانة للحصول على 5 ألواح أجار من الفطريات المستخدمة في فحص TLC-DB.
يعد TLC-DB مفيدا مقارنة بالتصوير الحيوي للتلامس والغمر لأنه يستخدم أنحف طبقة من الآجار واللقاح ، مما يقلل من الاعتماد على انتشار المستقلبات في طبقة الآجار ، والتي يمكن أن تسمح بكميات أقل من المنتجات الطبيعية للحث على تثبيط مسببات الأمراض17. استخدمت النتائج المنشورة سابقا باستخدام طرق التوصيف الحيوي TLC معلقا بوغيا للممرض لإكمال الفحص17. على الرغم من أن هذا يسمح بالتحكم الدقيق في تركيز التعليق ، إلا أنه قد يكون من الصعب للغاية ويستغرق وقتا طويلا للحث على تكاثر بعض الفطريات24. يبسط هذا التعديل الفحص إلى حد كبير ويسمح بإكمال الفحص باستخدام مسببات الأمراض الفطرية التي يصعب إبواغتها وربما تم تجنبها سابقا لهذه الطريقة.
يمكن أن تؤثر كتلة المستخلص البكتيري المستخدم في الفحص على النتائج. إذا تم تطبيق القليل جدا من المستخلص على لوحة TLC ، فمن الممكن ألا يتم تجاوز الحد الأدنى من التركيز المثبط للمركب النشط ، ولن يتم اكتشاف النشاط الحيوي. نتيجة لذلك ، في بعض الحالات ، وكما هو موضح في الشكل 1 والشكل 2 ، من المفيد زيادة التحميل على لوحة TLC ، مما يضر بالفصل من أجل القدرة على اكتشاف النشاط بسهولة. وبالمثل، يجب ألا يكون حمل مسبب المرض الذي يتم رشه على اللوحة منخفضا جدا؛ حيث لن يكون هناك وسائط كافية لدعم نمو مسببات الأمراض. يمكن ضبط هذه الطريقة بسهولة لاستيعاب مجموعة متنوعة من المستخلصات البكتيرية ومسببات الأمراض ، وقد ضمنت كميات المستخلصات الميكروبية واللقاحات الموضحة في البروتوكول إمكانية اكتشاف النشاط الحيوي للعديد من مسببات الأمراض والمستخلصات الميكروبية. إذا لم يتم ملاحظة أي مناطق تثبيط عند الانتهاء من الفحص ، فقد يشير ذلك إلى أحد الإجراءات التالية. أولا ، قد لا تكون المستقلبات النشطة موجودة في المستخلص المطبق بسبب استخدام الوسائط غير المتوافقة لنمو البكتيريا أو بسبب نشاط البكتيريا الذي لا يكون نتيجة لإنتاج NP. يمكن إكمال فحص انتشار القرص مع المستخلص لتأكيد أو نفي وجود NPs نشطة في المستخلص. إذا لم يظهر اختبار انتشار القرص أي قمع لمسببات الأمراض ، فيمكن اختبار الوسائط الأخرى لتحديد ما إذا كانت الظروف الأخرى تنتج NPs نشطة بيولوجيا. إذا كان فحص انتشار القرص يشير إلى أن المستخلص يثبط العامل الممرض ، فقد يلزم تطبيق كتلة أكبر من المستخلص البكتيري على لوحة TLC ، وفي هذه الحالة يمكن محاولة إجراء اختبار آخر.
تعد مقارنة المستقلبات في ZOI بالمستخلص الخام أمرا ضروريا لتحديد NPs النشطة. في الفحص ، يمكن استقلاب المستقلبات من المستخلص الخام أو تعديلها بواسطة العامل الممرض ، والذي يمكن ملاحظته عبر LC-MS. وبالتالي ، يمكن اعتبار المستقلبات التي تحدث في كل من المستخلص الخام و ZOI فقط NPs التي تنتجها البكتيريا قيد الدراسة. إذا لم يتمكن المرء من ربط المستقلبات المستخرجة من ZOI بالمستقلبات في المستخلص الخام ، فيمكن تحضير لوحة TLC ، كما هو موضح في الخطوة 5. دون إكمال مقايسة السيرة الذاتية ، استخرج المستقلبات من لوحة TLC في نفس وقت الاحتفاظ الذي لوحظ في الفحص المكتمل. هذا من شأنه أن يسمح بارتباط أسهل بين المستقلبات في ZOIs والمستخلص الخام ، مما يتسبب في قمع مسببات الأمراض.
أحد عيوب TLC-DB هو أن دقة TLC أقل بكثير من تلك التي تحققت عند استخدام تقنيات فحص microwell التقليدية ، والتي تتطلب كروماتوغرافيا سائلة للفصل. وبالتالي ، من الشائع وجود مستقلبات متعددة في منطقة التثبيط حيث قد لا تساهم بعض المستقلبات في النشاط الحيوي. يمكن أن تحدث هذه المشكلة أيضا بسبب ممارسة التحميل الزائد على لوحة TLC لمراقبة النشاط الحيوي بشكل أكثر وضوحا. تم نشر الأعمال الحديثة باستخدام TLC (HP-TLC) عالي الأداء ، مما يحسن الدقة بشكل كبير ويمكن أن يسمح بأتمتة تطوير TLC وهو أمر مستحيل عند استخدام TLCالتقليدي 14،21،22،23. أيضا ، يمكن تطوير الألواح في بعد ثان (2D-TLC) لمزيد من المستقلبات المنفصلة مع أوقات احتفاظ مماثلة. ومع ذلك ، ينبغي للمرء أن يقيم ما إذا كانت زيادة الوقت وتكلفة المواد هي حل وسط جدير بالاهتمام لزيادة الدقة التي تم الحصول عليها من HP- و 2D-TLC25.

تتسبب مسببات الأمراض الزراعية الفطرية في خسائر كبيرة في جودة المحاصيل وغلة المحاصيل في جميع أنحاء العالم ، مما يساهم في التحديات الاقتصادية وتحديات العرض لنظام إنتاج غذائي عالمي مستقر 1,2. يمكن الوقاية من الأضرار الناجمة عن مسببات الأمراض عن طريق تربية أصناف مقاومة للعدوى واستخدام نظم متكاملة لإدارة المحاصيل ، بما في ذلك تناوب المحاصيل وممارسات إدارة الأراضي لقمع انتشار مسببات الأمراض 3,4. على الرغم من أن هذه الطرق تقلل من الأضرار التي تلحق بالمحاصيل ، إلا أن المبيدات الكيميائية تستخدم بشكل عام جنبا إلى جنب لقتل الهياكل التناسلية الفطرية بنشاط في الحقل ومنع الضرر وانخفاض الغلة. على الرغم من فعاليتها ، إلا أن استخدام مبيدات الآفات الكيميائية له العديد من العيوب ، بما في ذلك الأضرار التي لحقت بالنظم الإيكولوجية المحيطة ، وانخفاض خصوبة التربة ، والمخاطر المرتبطة بصحة الإنسان ، وتطوير مقاومة مسببات الأمراض ، وهذا الأخير يسبب جرعات أعلى من المبيدات الحشرية المطلوبة كل عام5،6،7.
لطالما اعتبرت منتجات إدارة الآفات ومسببات الأمراض القائمة على الميكروبات بدائل محتملة أو مكملة لمبيدات الآفات الاصطناعية. منذ أوائل أواخر القرن التاسع عشر ، تم استخدام Bacillus thuringiensis على نطاق واسع للسيطرة على الآفات الزراعية ومسببات الأمراض كمعالجة للبذور ، كرذاذ ورقي ، وفي المعالجة المباشرة للتربة8. وقد سميت هذه المنتجات بالمبيدات الحيوية وتتميز بأنها كائنات دقيقة تحدث بشكل طبيعي أو مواد كيميائية حيوية يمكنها قتل أو قمع أو تقليل قوة الآفة أو العامل الممرض المستهدف. يمكن للمبيدات الحيوية التحكم في نمو العامل الممرض من خلال آليات مختلفة ولكن الأكثر شيوعا تفعل ذلك من خلال إفراز المستقلبات الثانوية9. لا تشارك المستقلبات الثانوية ، التي يشار إليها غالبا باسم المنتجات الطبيعية ، في عملية التمثيل الغذائي الأولي ولكن يتم إنتاجها كميزة تطورية للتغلب على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى10.
تقدم المبيدات الحيوية العديد من المزايا على نظيراتها الاصطناعية. إنها تشكل مخاطر سمية منخفضة على البيئة والبشر مقارنة بمنتجات إدارة الآفات الاصطناعية 9,10. نظرا لأن معظم مبيدات الآفات الحيوية موجودة بشكل طبيعي في البيئة منذ آلاف السنين ، فإن مسارات التحلل البيولوجي للمستقلبات الميكروبية موجودة في البيئة ، مما يحد من إمكانية تلوث التربة أو النظام الإيكولوجي ويقلل من أوقات الإقامة التي تساهم في أن تكون مبيدات الآفات الاصطناعية مدمرة للبيئة11. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من المبيدات الحيوية المستخدمة للتخفيف من عدوى مسببات الأمراض تظهر أيضا خصائص تعزيز نمو النبات ، والتي يمكن أن تزيد من التوافر البيولوجي للمغذيات وتحفز المقاومة الجهازية للنبات12.
الأكثر شيوعا ، يتم تطبيق المبيدات الحيوية في شكل لقاح ميكروبي ، ويتم إفراز NPs بواسطة الكائنات الحية الدقيقة الحية في الموقع12،13. في مثل هذه الحالة ، يكون تحديد مصدر نشاط مبيد الآفات الحيوي ذا قيمة كبيرة. يوفر القيام بذلك نظرة ثاقبة لآلية عمل المبيد الحيوي ، ويساعد في بناء حالة لحماية الكائنات الحية الدقيقة ببراءة اختراع ، ويمكن أن يكون له تأثير علمي كبير إذا كانت هياكلها جديدة. ولكن الأهم من ذلك هو أن تحديد المصدر النشط بيولوجيا يسترشد بإمكانيات الصياغة لمنتج مبيد بيولوجي نهائي. إذا كان NP نفسه نشطا ، يمكن للمرء استخدام الكائنات الحية الدقيقة كمصنع للجزيئات الحيوية لإنتاج المبيدات الحيوية على نطاق واسع. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من NPs التي تم استكشافها للمكافحة الحيوية لها أيضا تطبيقات محتملة في الطب البشري ، مما يجعلها أكثر قيمة من الناحية الاقتصادية8.
تعد مقايسات التصوير الحيوي المباشر للكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة (TLC-DB) طريقة غير مكلفة ومباشرة للعزل الموجه بالنشاط الحيوي وتحديد مستقلبات المبيدات الحيوية. على الرغم من أن هذه التقنية تستخدم بشكل شائع لفصل اختبار النشاط الحيوي للمواد الكيميائية النباتية عن المستخلصات النباتية الخام ، إلا أنها تتمتع أيضا بإمكانات كبيرة لتحليل المستخلصات الميكروبية14. يوفر TLC فصلا سريعا وغير مكلف ل NPs في مستخلص ميكروبي خام ، وبعد الطلاء بتعليق مسببات الأمراض في الوسائط ، يمكن تصور المناطق التي تحتوي على مستقلبات نشطة بسهولة. يمكن كشط هذه المناطق من الصفيحة واستخراجها للتحليل الكيميائي بواسطة كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء مقترنة بقياس الطيف الكتلي (UPLC-MS) لتحديد المستقلبات المعروفة. يمكن عزل المستقلبات التي لا تتطابق مع المركبات المبلغ عنها سابقا بكميات أكبر عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة للخضوع لدراسات توضيح البنية باستخدام تقنيات مثل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية15.
توضح هذه المقالة نظاما نموذجيا لاكتشاف وتحديد مبيدات الآفات الحيوية NPs باستخدام TLC-DB مع Bacillus spp. والممرض الزراعي Sclerotinia sclerotiorum. يقدم الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية على إجراء TLC-DB.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية للخطوات 4-7 من إجراء TLC-DB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-5 mL single channel Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11020-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Thin Layer Chromatography Sprayer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT422530-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm Petri plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#181;L single channel pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76169-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottle</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS13951L</td>
			<td>Must be autoclave safe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe with needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8935L75</td>
			<td>Detachable needle is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11020-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL scintilation vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76538-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-01850-34</td>
			<td>8 L, 115 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bin</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1216H91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane &#8805;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1113-4LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate &#8805;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1123-4LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28297-846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA80501-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>CleanTech</td>
			<td>1000-6-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td>Waters</td>
			<td>LITR10064178</td>
			<td>UPLC/MS/MS TQD system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>700201000</td>
			<td>Temperature collector&#160;-50 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate Hydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CAAA10807-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#8805;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH2018-5GLP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89402-824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA90000-758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA90003-494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potsasium Phosphate Dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potsasium Phosphate Monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Gauge 6mm Union Straight 0-10 bar (0-145 psi)</td>
			<td>Tameson</td>
			<td>F25U6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas F Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90003-352</td>
			<td>Also known as Flo Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58697-U</td>
			<td>1/16 inch inner diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Inoculation loops with needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76534-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tinfoil</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1086F24</td>
			<td>Can be purchased from supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S 25 Glass Plates 20 X 20 cm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1205Q12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>1472100</td>
			<td>98 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76549-928</td>
			<td>Must accomadate 15 mL and 50 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman in-line HEPA-VENT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA67235000</td>
			<td>10 filters, 1/4 to 3/8 inch inlet/outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-370</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioassay-guided identification of natural products for biocontrol by thin layer chromatography-direct bioautography

التصوير الحيوي المباشر لكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC-DB) هو اختبار حيوي راسخ يستخدم لفصل وتحديد المنتجات الطبيعية (NPs) المعادية لمسببات الأمراض المستهدفة. إنه خيار سريع وغير مكلف وبسيط للعزل الموجه بالمقايسة الحيوية وتحديد NPs التي تتوقف على الفصل بواسطة TLC إلى جانب التطبيق المباشر لمسببات الأمراض المستهدفة لفحص النشاط الحيوي. يستخدم عادة لتحليل المستخلصات النباتية النشطة بيولوجيا ، والكشف عن النشاط المثبط ضد البكتيريا والفطريات والإنزيمات. ومع ذلك ، فإن لديها إمكانات كبيرة في اكتشاف NP البكتيرية ، لا سيما لتقييم NPs البكتيرية ضد مسببات الأمراض الزراعية ذات الصلة ، وهو أمر ذو قيمة لاكتشاف وتطوير مبيدات حيوية جديدة للصناعة الزراعية. علاوة على ذلك ، فهو بروتوكول قابل للضبط يمكن تطبيقه على مسببات الأمراض المستهدفة الأخرى أو مصادر NPs في برامج البحث المتعلقة باكتشاف وتحديد المركبات النشطة بيولوجيا. هنا ، نصف نظاما نموذجيا لاكتشاف وتحديد مبيدات الآفات الحيوية NPs باستخدام TLC-DB مع Bacillus spp. والممرض الزراعي Sclerotinia sclerotiorum.

Fungal agricultural pathogens cause significant losses in crop quality and yields worldwide, contributing to the economic and supply challenges of a stable global food production system1,2. Pathogen damage can be prevented by breeding cultivars resistant to infection and using integrated crop management systems, including crop rotations and land management practices to suppress pathogen proliferation3,4. Though these methods reduce damage to crops, chemical pesticides are generally used in tandem to actively kill fungal reproductive structures in the field and further prevent damage and yield reductions. Although effective, chemical pesticide usage has many drawbacks, including damage to surrounding ecosystems, a decline in soil fertility, associated human health risks, and the development of pathogen resistance, the latter causing higher doses of pesticides to be required each year5,6,7.
Microbial-based pest and pathogen management products have long been considered potential alternatives or complementary to synthetic pesticides. Since the early 1900s, Bacillus thuringiensis has been widely used to control agricultural pests and pathogens as a seed treatment, as a foliar spray, and in direct soil treatment8. Such products have been named biopesticides and are characterized as naturally occurring microorganisms or biochemicals that can kill, suppress, or reduce the vigor of a target pest or pathogen. Biopesticides can control the growth of a pathogen through various mechanisms but most commonly do so through the secretion of secondary metabolites9. Secondary metabolites, often referred to as natural products, are not involved in primary metabolism but are produced as an evolutionary advantage to outcompete other microorganisms10.
Biopesticides offer many advantages over their synthetic counterparts. They pose a low toxicity risk to the environment, fauna, and humans compared to synthetic pest management products9,10. Since most biopesticides have existed naturally in the environment for millennia, biodegradation pathways for microbial metabolites exist in the environment, limiting the possibility of soil or ecosystem contamination and reducing residence times that contribute to synthetic pesticides being so environmentally destructive11. Additionally, many biopesticides used for mitigating pathogen infection also exhibit plant growth-promoting properties, which can increase nutrient bioavailability and induce plant systemic resistance12.
Most commonly, biopesticides are applied in the form of microbial inoculum, and NPs are secreted by live microorganisms in situ12,13. In such a case, identifying the source of the activity of a biopesticide is of great value. Doing so provides insight into the mechanism of action of the biopesticide, aids with building a case for the protection of a microorganism with a patent, and can have a significant scientific impact if their structures are novel. Most importantly, however, identification of the bioactive source informs formulation possibilities for a downstream biopesticide product. If the NP itself is active, one can use the microorganism as a biomolecule factory for large-scale biopesticide production. Additionally, many NPs that have been explored for biocontrol also have potential applications in human medicine, making them even more economically valuable8.
Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) assays are an inexpensive and straightforward method for the bioactivity-guided isolation and identification of biopesticidal metabolites. Although the technique is commonly used for separating bioactivity testing of phytochemicals from crude plant extracts, it also has great potential for the analysis of microbial extracts14. TLC provides fast and inexpensive separation of NPs in a crude microbial extract, and after coating with a media pathogen suspension, zones that contain active metabolites are easily visualized. Those zones can be scraped from the plate and extracted for chemical analysis by ultra-high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) to identify known metabolites. Metabolites that do not match previously reported compounds can be isolated in larger quantities via liquid chromatography to undergo structure elucidation studies using techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy and X-ray crystallography15.
This article describes a model system for discovering and identifying biopesticide NPs using TLC-DB with Bacillus spp. and the agricultural pathogen Sclerotinia sclerotiorum. Figure 1 provides a schematic overview of the TLC-DB procedure.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic overview of steps 4-7 of the procedure of TLC-DB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

تسليط الضوء على المؤلف: اكتشاف مبيدات حيوية جديدة من المنتجات الطبيعية المشتقة من ميكروبات التربة النشطة بيولوجيا

التحديد الموجه بالمقايسة الحيوية للمنتجات الطبيعية للمكافحة الحيوية بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة - التصوير الحيوي المباشر

In the agricultural industry, research concerning the discovery of alternatives to synthetic pesticides has been growing significantly over the past two decades. By examining the natural products that bioactive soil microbes produce, our team envisions discovering new bio pesticides that already exist in the environment. The layer chromatography direct biotagraphy or TLCDB has primarily been used to determine the bioactivity of plant extracts against pathogenic bacteria and fungi.In this video, bacterial extracts are assayed without the need to induce spoilation of the pathogen, which allows for the examination of a wider range of pathogens. TLCBD will continue to be one of the tools that we use to focus on the discovery of novel natural products For biocontrol, this will benefit the agriculture and AgriFood sectors and help mitigate the resistance that pathogens have been developing to commercial pesticides.

عند فصل المستخلصات الميكروبية بواسطة TLC ، يجب تشتيت المستقلبات على طول لوحة TLC عموديا. تحت الضوء المرئي ، قد يكون من الصعب عرض المستقلبات التي لا تمتص في نطاق الضوء المرئي. ومن ثم، يمكن أن يساعد التصوير تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في عرض فصل الأيضات، كما هو موضح في الشكل 2A، B. بعد فترة الحضانة، يجب أن يبدو أن مسبب المرض ينمو بالتساوي عبر اللوحة بأكملها باستثناء الضوابط الموجبة ومناطق التثبيط حيث توجد المستقلبات النشطة، كما هو موضح في الشكل 2C.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig02v2.jpg"> الشكل 2: فصل المستخلصات الميكروبية بواسطة TLC. (أ) تم تطوير لوحة TLC تحتوي على تسعة مستخلصات عصوية تم تصويرها تحت الضوء المرئي و (B) تحت 320 نانومتر من الأشعة فوق البنفسجية قبل تطبيق اللقاح الفطري. (ج) اختبار التصوير الحيوي المكتمل مع نمو مسببات الأمراض الذي لوحظ عبر اللوحة باستثناء المكان الذي يتم فيه تثبيط النمو حول الضوابط الإيجابية ، و ZOI لكل مستخلص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig02largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يتم تحليل المستقلبات المستخرجة من مناطق التثبيط بواسطة LC-MS ومقارنتها بالمستخلص الخام لتحديد NPs المسؤولة عن العداء ضد العامل الممرض. يجب أن يكون للمستقلبات المطابقة نفس وقت الاحتفاظ وأنواع الأيونات الجزيئية ليتم اعتبارها متطابقة. بمجرد تحديد المستقلبات النشطة ، يمكن زراعة الثقافة البكتيرية بكميات كبيرة لعزل المستقلبات النشطة ذات الأهمية للكيمياء الهيكلية أو الدراسة البيولوجية.

وصفنا استخدام مقايسة الكروماتوغرافيا الحيوية المباشرة ذات الطبقة الرقيقة وقياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة لتحديد المنتجات الطبيعية الميكروبية التي تظهر العداء ضد مسببات الأمراض الفطرية باستخدام العامل الممرض Sclerotinia sclerotiorum وعزلات Bacillus المبيدة للمبيدات الحيوية كنظام نموذجي.

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are ...

bioassay-guided-identification-natural-products-for-biocontrol-thin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography

758 Views.  Agriculture and Agri-Food Canada. في الصناعة الزراعية ، نمت الأبحاث المتعلقة باكتشاف بدائل لمبيدات الآفات الاصطناعية بشكل كبير خلال العقدين الماضيين. من خلال فحص المنتجات الطبيعية التي تنتجها ميكروبات التربة النشطة بيولوجيا ، يتصور فريقنا اكتشاف مبيدات الآفات الحيوية الجديدة الموجودة...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: اكتشاف مبيدات حيوية جديدة من المنتجات الطبيعية المشتقة من ميكروبات التربة النشطة بيولوجيا

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are antagonistic against a target pathogen. It is a rapid, inexpensive, and simple option for the bioassay-guided isolation and identification of NPs that hinges on separation by TLC coupled with the direct application of a target pathogen to examine bioactivity. It is typically used for the analysis of bioactive plant extracts, detecting inhibitory activity against bacteria, fungi, and enzymes. That being said, it has great potential in bacterial NP discovery, particularly for evaluating bacterial NPs against pertinent agricultural pathogens, which is valuable for discovering and developing novel biopesticides for the agriculture industry. Furthermore, it is a tunable protocol that could be applied to other target pathogens or sources of NPs in research programs concerning the discovery and identification of bioactive compounds. Herein, we describe a model system for discovering and identifying biopesticide NPs using TLC-DB with Bacillus spp. and the agricultural pathogen Sclerotinia sclerotiorum.

We describe the use of thin-layer chromatography direct bioautography assay and liquid chromatography-mass spectrometry to identify microbial natural products that display antagonism against fungal pathogens using the pathogen Sclerotinia sclerotiorum and biopesticidal Bacillus isolates as a model system.

Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography Assay for Microbial Natural Products Displaying Antagonism Against Fungal Pathogens

To begin, using a pipette, spot five microliters of each extract two centimeters apart on the dots marked on the bottom line of the thin-layer chromatography, or TLC, plate. Let the spots dry on the TLC plate and repeat until about five milligrams of each extract are loaded onto the plate. Prepare a 1:2 solution of dichloromethane and methanol in a TLC developing tank.Put the TLC plate into the developing tank and develop it, until the solvent reaches the line marked two centimeters from the top of the plate. Once developed, remove the TLC plate from the tank. Immediately, spot the positive controls on the dots above the solvent line.Place the plate in an ethanol-sterilized TLC plate box before all solvent evaporates. Scrape the mycelial mat of the five pathogen plates using a sterile metal spatula. Then, transfer it into a 50-milliliter centrifuge tube.After adding 25 milliliters of Potato Dextrose Broth amended with agar, add sterile glass beads to the tube, and vortex for five minutes to break up the mycelial mat. After assembling the chromatography sprayer in the hood, attach the tubing. Then, attach the flow meter to the setup.Transfer the mycelial suspension to the chromatography sprayer using a sterile syringe with a needle tip to ensure large pieces of mycelia do not clog the sprayer. Place the previously developed TLC plates on sterile paper towels in the laminar flow hood to reduce hand contact with the plate, while applying the media suspension. Connect the pathogen sample to the assembled sprayer and apply three coats of the suspension to the TLC plate, allowing the plate to dry completely between applications.Next, prepare the incubation setup by adding 50 milliliters of sterile water into a sterilized plastic plate box. Place four Petri plates in it for the TLC plate to sit on. Also, place sterilized folded cellulose sheets or filter paper on each side of the box to hold moisture.Place the completed assay plate onto four empty Petri dishes in the box. Incubate the assay for three days to one week or until an even layer of mycelia grows across the plate, except for around the positive controls and zone of inhibition. Then, using a metal spoon, scrape the silica off the inhibition zones and place it into microcentrifuge tubes.Add 500 microliters of methanol to each tube and vortex to extract the metabolites from the silica. Centrifuge the tubes to pellet the silica and transfer the supernatant to liquid chromatography vials for analysis. Imaging under ultraviolet light showed the separation of metabolites on the TLC plate.After the incubation, the pathogen appeared to grow evenly across the entire plate, except over the positive controls and the inhibition zones.