تقييم التدفق الخلوي لتعبير CAR المعتمد على الأكسجين في الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية

للبدء ، قم بتقسيم الخلايا التائية المستزرعة المحولة مستقبلات المستضدات الوهمية إلى لوحين من 12 بئرا يحتويان على ملليلتر من TGM. ضع طبقا واحدا مباشرة في حاضنة مرطبة تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. ضع اللوحة الأخرى في غرفة حاضنة نيتروجين الأكسجين وثاني أكسيد الكربون المتنقلة مع ضبط مستوى الأكسجين مسبقا على 1٪ اجمع 500،000 خلية من الألواح كل 24 ساعة في كلتا الحالتين في أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 ملليلتر.

أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 500 غرام لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، ماصة بلطف ملليلتر واحد من PBS في بيليه الخلية. أعد تعليق الخلايا الحبيبية في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.

ثم أضف 50 ميكرولترا من واحد إلى 100 تخفيف من الجسم المضاد المترافق المضاد للعلم phycoerythrin. ماصة التعليق لخلط جيدا. بعد الحضانة ، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب.

أجهزة الطرد المركزي التعليق المختلط عند 500 غرام لمدة خمس دقائق. الآن ، ماصة من الطافات من كل أنبوب. ثم أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.

نقل تعليق الخلية الناتجة إلى خمسة أنابيب قياس التدفق الخلوي ملليلتر. إجراء قياس التدفق الخلوي على تعليق الخلية لتحديد تعبير مستقبلات المستضد الخيمري السطحي. قم بإعداد أنابيب جديدة فارغة و CAR.

انقر فوق قناة FSCA و FSCH و SSCA و SSCH و PE و FITC. ثم قم بإنشاء أربعة مخططات مبعثرة لتحديد الخلايا المفردة والخلايا الحية والخلايا الموجبة ل GFP والخلايا الموجبة PE بالتتابع. تعيين المعلمات لجمع 10،000 خلية حية واحدة.

انقر على الحصول على البيانات. بعد استقرار تجميع الخلايا، انقر فوق تسجيل البيانات. لتحديد موقع البوابات وفقا للتحكم السلبي ، قم ببوابة الخلايا الموجبة ل EGFP و phycoerythrin لقياس إيجابية phycoerythrin ومتوسط شدة التألق.

أظهرت حساسية نقص الأكسجة لكل اثنين من CAR المستهدفين تعبيرات عالية بشكل ملحوظ عن CAR في ظل ظروف نقص الأكسجين بالنسبة لظروف normoxic.