تلطيخ أقسام أنسجة الرئة في الفئران باستخدام Isolectin B4 و DAPI لتصور كثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية

للبدء ، احصل على شريحة مدمجة بالبارافين من أنسجة رئة الفأر وضعها في فرن 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. للتلوين ، اغمر الشريحة بقسم المناديل بالتتابع في برطمانات التلوين التي تحتوي على المحاليل المناسبة. قم بتخفيف محلول استرجاع مستضد سترات الصوديوم المعدل 50 ضعفا بالماء منزوع الأيونات.

بعد التسخين المسبق لمستخلص المستضد في الميكروويف على طاقة عالية ، ضع الشريحة فيه لمدة 15 دقيقة حتى تغلي. بعد أن تبرد الشريحة إلى درجة حرارة الغرفة ، اغسلها مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما. ثم تخلل الأنسجة مع 0.25٪ تريتون مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما.

قم بتطويق الأنسجة بقلم الكيمياء المناعية واحتضان الشريحة بنسبة 5٪ BSA في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بتخفيف الإسولكتين B4 ، أو IB4 ، بنسبة 1٪ BSA إلى نسبة 1 إلى 50. بعد إزالة الماء الزائد ، احتضان قسم الأنسجة ب 50 إلى 100 ميكرولتر من IB4 المخفف طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منها وتخلل 0.25٪ تريتون لمدة 10 دقائق. ثم احتضان قسم الأنسجة ب 50 إلى 100 ميكرولتر DAPI في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ثلاث غسلات PBS ، ضع قطرة من وسيط التثبيت المضاد للبهتان على الشريحة ، وتجنب التعرض للضوء.

قم بتركيب الشريحة المجففة بالهواء تحت المجهر الفلوري لالتقاط صور للنواة والإشارات المستهدفة. يتيح هذا البروتوكول التوطين الدقيق ومراقبة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية باستخدام IB4 لتلوين الخلايا البطانية الدقيقة في فصوص رئة الفئران المختلفة تحت المجهر الفلوري.