عزل الإكسوسومات من الخلايا السرطانية الظهارية المبيضية للفأر لتوليد رقعة الإبرة الدقيقة

للبدء ، خذ خلايا سرطان المبيض المبيض المستزرعة. قم بإزالة وسط الاستزراع من أطباق بتري واغسله مرتين باستخدام DPBS. أضف 20 ملليلتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco بدون FBS ومحلول البنسلين والستربتومايسين.

احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. ثم جمع طاف ثقافة الخلية من 20 طبق بتري بقطر 15 سم. أجهزة الطرد المركزي في 300 غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وجمع طاف.

أجهزة الطرد المركزي في طاف 2،000 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وجمع طاف لإزالة الحطام الخلوي. الآن قم بتشغيل مضخة التفريغ وتوصيلها بمدخل الهواء لنظام ترشيح الفراغ. قم بتصفية المادة الطافية من خلال غشاء البولي إيثر سلفون 0.22 ميكرون لإزالة الحويصلات أو الشوائب التي يزيد حجمها عن 0.22 ميكرون.

أضف 15 ملليلترا من المادة الطافية المفلترة إلى الأنبوب الداخلي لأنبوب الترشيح الفائق 100 كيلو دالتون. أجهزة الطرد المركزي في 3،500 غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم أخرج السائل من الأنبوب الخارجي.

بعد ذلك ، اجمع السائل من الأنبوب الداخلي. أضف ملليلتر واحد من DPBS إلى الأنبوب الداخلي. ماصة مرارا وتكرارا لإعادة تعليق exosomes ، ومن ثم جمعها.

أجهزة الطرد المركزي السائل في 10،000 غرام لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي سريع المفاجئة سعة ستة ملليلتر وأغلقه بمانع تسرب حراري. قطع فتح الأنبوب بعد الطرد المركزي ultracentribuled لمدة ساعتين.

بمجرد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من DPBS للحصول على محلول exosome.