تجميع وتلدين دوبلكس الحمض النووي لتوصيف معالجة الحمض النووي الأنزيمي باستخدام قليل النيوكليوتيدات المعدلة

للبدء ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالأنبوب المحتوي على قليل النوكليوتيد المجفف بالتجميد بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. أعد تعليق قليل النوكليوتيدات في المخزن المؤقت TE لإعداد مخزون رئيسي من 100 ميكرومولار ودوامة الأنبوب برفق. قم بتخفيف حصة المخزون الرئيسي باستخدام مخزن TE المؤقت لتحضير مخزون 10 ميكرومولار وإعداد المزيج الرئيسي للتفاعل.

بعد توزيع المزيج على الأنابيب المطلوبة ، قم بتلدين قليل النيوكليوتيدات في دورة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. دع الأنبوب يبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. ثم أضف العوامل المساعدة للنيوكليوتيدات والمكونات العازلة الأخرى الحساسة للحرارة إلى المزيج الرئيسي.

إذا لزم الأمر ، قم بتخزين المزيج على حرارة 20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. اجمع بين 22.5 ميكرولتر من مزيج الركيزة الرئيسي مع 2.5 ميكرولتر من إنزيم ربط الحمض النووي في أنبوب PCR. ضع أنابيب التفاعل على الفور في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

لإخماد التفاعل ، أضف خمسة ميكرولترات من صبغة التحميل واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.