تعداء الخلايا HEK293T بوساطة البولي إيثيلين (PEI) وبذر الخلايا بعد التعدي

للبدء ، خذ HEK293T مزروعة من الحاضنة. استنشق وسائط الاستزراع الموجودة من كل بئر ، وأضف ملليلترين من الوسائط الجديدة لكل بئر. لنقل الخلايا باستخدام الحمض النووي البلازميد المنقسم R-loop ، امزج الحمض النووي وجزيرة الأمير إدوارد في 200 ميكرولتر من DMEM في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مليلتر لكل بئر.

قم بتدوير الحمض النووي وجزيرة الأمير إدوارد بسرعة عند المستوى الثامن لمدة ثانيتين تقريبا للتأكد من خلطهما جيدا لتشكيل معقد. ثم قم بتدويرها لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغير. بعد الحضانة ، قم بإسقاط الخليط على سطح وسط الاستزراع في صفيحة البئر الستة التي تحتوي على الخلايا.

اضغط على الطبق برفق لتوزيع الخليط بالتساوي ، واحتضنه في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات. بعد ذلك ، قم بإزالة لوحة الآبار الستة من الحاضنة ، واستنشق الوسائط ، واغسل كل بئر بملليلترين من DPBS. بمجرد إزالة DPBS ، أضف 350 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين-EDTA فينول أحمر.

في نهاية الحضانة ، أضف 1.7 مل من الوسائط إلى كل بئر لإيقاف تفاعل التربسين. الآن ، انقل الخلايا مع الوسائط إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ، وقم بالدوران عند 300 جم لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي على الطاولة. استنشق الوسائط وإعادة تعليق بيليه الخلية مع ملليلتر واحد من الوسائط الطازجة.

لزرع الخلايا في لوحة 96 بئر مطلية ب poly-D-lysine ، أضف الحجم اللازم من الخلايا في أنبوب سعة 50 مليلتر جنبا إلى جنب مع الحجم المناسب من الوسائط. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من معلق الخلية المخفف في كل بئر من البئر البالغ عددها 96 بئرا. احتضان الخلايا لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.