للبدء ، قامت البذور بتقسيم خلايا HEK293 T المنقولة في لوحة 96 بئر مطلية ب Poly-D-Lysine. بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاثة حلول جديدة من Rhosin و Ehop-016 و ZCL278 في 1.7 ملليلتر Microfuge II.أضف ركيزة الخلية الحية لرينيلا لوسيفيراز ، مخفف من 1 إلى 2 ، 000 ، إلى تركيز نهائي يبلغ 30 ملليمولار لكل محلول. لصنع محلول ZCL278 0.55 و 50 ميكرومولار ، قم بإجراء عمليات تخفيف تسلسلية باستخدام 50 ميكرومولار ZCL278 الأولي في وسائط الاستزراع.
ثم قم بإزالة الوسائط من كل بئر من لوحة البئر 96 التي تحتوي على خلايا منقولة. أضف 50 ميكرولترا من خليط الوسائط الكيميائية والركيزة إلى كل بئر. بعد احتضان الخلايا لمدة ساعة أو ساعتين أو خمس ساعات ، قم بتحميل اللوحة على قارئ لوحة التلألؤ وقم بقياس اللمعان.
تأكد من تشغيل قارئ اللوحة قبل البدء. قم بالوصول إلى برنامج Microplate Reader وانقر فوق جلسة جديدة لإنشاء ملف جديد. انقر فوق الحاضنة لضبط درجة حرارة قارئ اللوحة على 37 درجة مئوية.
تحقق من خيار درجة الحرارة واكتب 37 درجة مئوية. ضمن تخطيط اللوحة ، اختر الخيار غير معروف وانقر واسحب البئر لتحديد الآبار المراد قياسها. ثم انتقل إلى البروتوكول ، وانقر فوق اللمعان ، واحتفظ بالإعدادات الافتراضية.
بمجرد اكتمال الإعداد ، قم بتحميل اللوحة مع الغطاء في قارئ اللوحة واختر لوحة التشغيل. انقر فوق ابدأ وستظهر نافذة حفظ الملف. أعد تسمية الملف وانقر فوق حفظ.
بمجرد اكتمال القراءة ، قم بإزالة اللوحة من قارئ اللوحة ثم انقر فوق لوحة التشغيل في الخيار لإعادة القارئ. بمجرد الانتهاء ، ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة المرطبة حتى القراءة التالية. في ساعة واحدة وساعتين وخمس ساعات من العلاج ، لم تظهر الخلايا المعالجة بروسين أي تغييرات كبيرة في نشاط لوسيفيراز مقارنة بالخلايا المعالجة DMSO للتحكم
أظهر مثبط Rac GTPase EHop-016 نشاطا أقل بكثير من لوسيفيراز من DMSO. كان للخلايا المعالجة ZCL278 نشاط لوسيفيراز أقل بكثير من DMSO الضابط في جميع النقاط الزمنية الثلاث. أظهرت أنشطة لوسيفيراز التي تم قياسها بعد ساعة وساعتين وخمس ساعات بعد العلاج استجابة تعتمد على الجرعة.
لا تزال التركيزات الأعلى من ZCL278 تظهر تغييرات كبيرة مقارنة ب DMSO الضابط.
