ربط ركيزة الحمض النووي الخطية ذات الوظائف المزدوجة بالخرز المغناطيسي المطلي بالستربتافيدين

تابع إجراء التفاعل بعد تشغيل طرفي ركيزة الحمض النووي الخطية. أولا ، خذ أربعة أعمدة تدور S-400 وقم بدوامة لهم لمدة 30 ثانية على الأقل لإعادة تعليق الراتنج. ثم ، قم بطردها لمدة دقيقة واحدة عند 735G لإزالة المخزن المؤقت للتخزين.

نقل الأعمدة لتنظيف أنابيب 1.5 ملليلتر. على الفور ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الحمض النووي الخطي الوظيفي المزدوج إلى كل عمود. أجهزة الطرد المركزي للأعمدة لمدة دقيقتين عند 735G لتدفق الحمض النووي عبر العمود مع الاحتفاظ بالنيوكليوتيدات غير المدمجة.

بعد تجميع التدفق الذي يحتوي على الحمض النووي من الأعمدة الأربعة ، قم بقياس الحجم باستخدام ماصة. بعد ذلك ، دوامة M-280 الخرز المغناطيسي المغلفة بالستربتافيدين لمدة 30 ثانية لإعادة تعليقها. انقل أربعة ملليغرامات من الخرزات المغناطيسية المعاد تعليقها إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 ملليلتر.

ضع الأنبوب في رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة لجمع الخرزات قبل إزالة المخزن المؤقت للتخزين. أعد تعليق الخرزات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت A عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان قبل احتضان الخرزات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. جمع الخرز عن طريق وضع الأنبوب في حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.

بعد إزالة المخزن المؤقت A ، أعد تعليق الخرزات في 400 ميكرولتر من 2X buffer A عن طريق الماصة. ثم أضف 400 ميكرولتر من محلول الحمض النووي الوظيفي إلى الخرز ، واخلطه برفق عن طريق الماصة. احتضان خليط الحمض النووي للحبة طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع الدوران من طرف إلى طرف.

في اليوم التالي ، استخدم الرف المغناطيسي لإزالة المادة الطافية قبل حساب الكمية الإجمالية للحمض النووي المرتبط بالخرز المغناطيسي. بعد ذلك ، اغسل الخرزات بالتتابع باستخدام المخزن المؤقت B والمخزن المؤقت C.أعد تعليق الخرز في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت C وقم بعمل أربعة حصص سعة 75 ميكرولتر.