تحضير الخلايا التي تعبر عن الفوسفاتيز المنظم بالراباميسين للترسيب المناعي لتقييم التحكم الزمني في فوسفاتيز التيروزين

للبدء ، احصل على خلايا HEK 293T ولوحة 800 ، 000 خلية لكل بئر في لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار في وسائط DMEM الكاملة. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتحقيق التقاء 60 إلى 80٪. بعد ذلك ، امزج ميكروغراما واحدا من كل حمض نووي بلازميد مع 200 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل وستة ميكرولترات من كاشف التعداد.

بعد 15 دقيقة من الحضانة ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من خليط التعداء لكل بئر من الخلايا. احتضان بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثالث ، أضف كمية مناسبة من الرابامايسين أو الإيثانول بشكل منفصل إلى الخلايا واحتضانها لمدة ساعة واحدة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.

ثم ضع الطبق على الثلج واغسل الخلايا برفق بثلاثة ملليلتر من PBS البارد. بعد إزالة PBS ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على إما رابامايسين أو إيثانول ، واكشط الخلايا باستخدام مكشطة الخلية. انقل العينة إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر وقم بعملها بالطرد المركزي الدقيق لمدة 10 دقائق عند 1,000 جم عند أربع درجات مئوية.

للتحقق من مستويات التعبير ، قم بنقل 20 ميكرولترا من المادة الطافية في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. احتضان العينة ب 20 ميكرولترا من 2x Laemmli buffer يحتوي على 5٪ بيتا ميركابتو إيثانول عند 95 إلى 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.