فحص نشاط الفوسفاتيز لتوصيف التنظيم الخيفي للفوسفاتيز باستخدام نظام RapR المنظم بالراباميسين

للبدء ، احصل على الخلايا HEK293T التي تعبر عن RapR-Shp2 وقم بإجراء الترسيب المناعي باستخدام بروتين G-Sepharose. بعد الترسيب المناعي ، اغسل السيفاروز مرتين لكل منهما ب 0.5 مل من محلول التحلل ، متبوعا ب 0.5 مل من محلول الغسيل. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت بعد الدوران النهائي.

ثم أضف 40 ميكرولترا من الفوسفو-باكسيلين في خليط إيميدازول العازل إلى كل عينة مع أو بدون ميكرومولار راباميسين واحد. قم بتحريك الأنبوب برفق وضعه على الفور في شاكر التسخين لمدة 40 دقيقة عند 32 درجة مئوية. اضبط شاكر التسخين على 1000 دورة في الدقيقة لضمان التقليب الكامل للعينة.

لإيقاف التفاعل ، أضف 40 ميكرولترا من 2X Laemmli المؤقت إلى كل عينة واحتضنها عند 95 إلى 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد أن تبرد العينات ، قم بتحميل 15 ميكرولترا من كل عينة على هلام بولي أكريلاميد SDS متدرج بنسبة أربعة إلى 15٪. قم بتشغيل بروتوكول اللطخة الغربية القياسي باستخدام أغشية PVDF.

أخيرا ، قم بمسح الجسم المضاد المضاد ل FLAG للكشف عن بنية RapR-Shp2 ومضاد الفوسفو باكسيلين للكشف عن البكسيلين الفسفوري في العينات. لم يظهر RapR-Shp2 النشط أي فوسفو باكسيلين ، على غرار Shp2 النشط بشكل أساسي ، مما يشير إلى الاحتفاظ بالنشاط الكامل. أظهر RapR-Shp2 غير النشط و Shp2 السلبي السائد مستويات فوسفو باكسيلين مماثلة ، مما يشير إلى عدم وجود نشاط عندما يكون غير نشط.