للبدء ، جهاز الطرد المركزي مرة واحدة في 10 إلى قوة سبعة خطوط خلايا HeLa تحتوي على شظايا تقييد التيلومير الحمض النووي عند 1 ، 000 جرام لمدة ثلاث دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS. بعد معالجة بروتيناز SDS K وكلوريد الصوديوم ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 16 ، 900 جم لمدة 10 دقائق.
انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد وأضف كمية متساوية من الأيزوبروبانول ، وتجنب الدهون العائمة أو الرواسب. جهاز طرد مركزي بسرعة عالية ، وغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول. بعد تجفيف حبيبات الحمض النووي ، قم بتعليقها بعناية في 475 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE واخلطها برفق عن طريق النقر على قاع الأنبوب.
الآن ، أضف 25 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل مليلتر من الحمض النووي الريبي واضغط على الأنبوب حتى تذوب الحبيبات تماما. بعد ذلك ، أضف 1/10 حجم من أسيتات الصوديوم ثلاثية المولار ومجلدين من الإيثانول البارد بنسبة 100٪ وضع الأنبوب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. بعد الطرد المركزي وغسل الإيثانول بنسبة 70٪ ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE إلى حبيبات الحمض النووي ، واضغط على الأنبوب للخلط ، وضعه عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين حتى يذوب تماما.
لهضم الحمض النووي ، اجمع بين أربعة ميكروغرامات من الحمض النووي الجيني مع ميكرولتر واحد من CviAII ، ولترين ميكرولترين من مخزن الهضم 10X ، والماء للوصول إلى الحجم الإجمالي 20 ميكرولترا. احتضن الخليط على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. في جهاز تدوير حراري ، سخني الخليط على حرارة 75 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.
ثم اخفض درجة الحرارة بمقدار 0.1 درجة مئوية كل 30 ثانية حتى تصل إلى 25 درجة مئوية. بعد التنظيف والتجفيف ، قم بتغطية زلات الغطاء السفلي ب 20 ميكرولتر من 0.1٪ من النيتروسليلوز وأضف الخرز المرجعي. اخبزي الغطاء على حرارة 100 درجة مئوية لمدة أربع دقائق.
قم بتجميع شطيرة خلية التدفق. وبعد التسخين عند 85 درجة مئوية ، استخدم مسحتين لتدليك المجموعة حتى يغلق Parafilm القناة. اغسل 10 ميكرولترات من حبات M-270 خمس مرات باستخدام 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعمل باستخدام مغناطيس.
بعد الغسيل ، أضف الخرزات فوق الحمض النووي الجيني المهضوم في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. قم بنفض الأنبوب برفق عدة مرات لخلط الخرزات وعينة الحمض النووي. اتركي الخليط على الثلج لمدة ساعة.
بعد الحضانة ، اغسل الخليط ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعمل ثلاث مرات باستخدام مغناطيس لسحب الخرزات لأسفل بفواصل زمنية مدتها 10 دقائق بين الغسل. أعد تعليق العينة في مخزن مؤقت يعمل ، وقم بتحميل 30 ميكرولترا من الخليط في خلية التدفق. اغسل الخرزات المغناطيسية غير المنضمة بعد 30 دقيقة.
بعد وضع خلية التدفق أعلى العدسة الموضوعية ، حدد زوجا من المغناطيس المكعب بحجم خمسة ملليمترات مرتبة في تكوين رأسي ، وقم بمحاذاة حامل المغناطيس مع المحور x لمسار ضوء الملقط المغناطيسي للتصوير. قم بتشغيل برنامج البرمجة الرسومية وقم بتوصيل وحدات التحكم بالملاقط المغناطيسية. اضبط مجال الرؤية لتحديد موقع حبة مرجعية في الجزء السفلي من خلية التدفق ، واضبط العدسة الموضوعية قليلا بحيث تظهر الخرزة المرجعية حلقات كسر واضحة.
اكتب برنامجا نصيا في MATLAB للتحكم في حركات المحرك لمقايسات منحدر القوة. قم باستيراد البرنامج النصي إلى برنامج برمجة رسومية لاختبار تجارب الجزيء الواحد. بمعدل تدفق بطيء ، قم بتحميل 200 ميكرولتر من 10 نانومولار TRF1 في خلية التدفق.
بعد 30 دقيقة من الربط ، اختر نصا لتجربة منحدر القوة بمعدل تحميل قوة زائد / ناقص بيكونوتون واحد في الثانية. قم بتسمية ملفات البيانات وقم بتشغيل التجربة. تم تأكيد سلامة الحمض النووي الجيني باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ، حيث يعرض TRS الناتج أطوال متسقة عبر خطوط الخلايا البشرية المختلفة.
تم الكشف عن تسلسلات التكرار التيلوميرية في TRS عبر النشاف الجنوبي ، مما يدل على إشارات تهجين واضحة. أظهرت منحنيات تمديد القوة من مقايسة منحدر القوة أنماطا متعرجة أثناء التمدد ، مما يشير إلى كسر تفاعلات البروتين الحمض النووي. أظهرت حركية التفكك لمجمعات بروتين الحمض النووي التيلوميري علاقة خطية بين القوة ومعدل التفكك.
علاوة على ذلك ، فإن عدم تجانس طول الحمض النووي التيلوميري من الخلايا البشرية يحقق في آلية تكوين الحلقة في التيلوميرات ذات الأطوال المختلفة.
