للبدء ، أضف حجما واحدا من الغرفة من بروتين الميوسين 7a البشري المنقى في مخزن مؤقت لحركة كلوريد الصوديوم 500 مللي مولار إلى غرفة التدفق ، واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل غرفة التدفق بثلاثة أحجام حجرة من ملليغرام واحد لكل مليلتر BSA في 150 مللي مولار لحركية كلوريد الصوديوم. بعد ذلك ، اسحب السائل باستخدام منديل نظيف عند المخرج لامتصاص السوائل الزائدة.
بعد ذلك ، قم بتدفق حجم غرفة واحد من 10 نانومولار من الرودامين والفالويد المسمى F-actin في 150 مللي مولار من المخزن المؤقت لحركة كلوريد الصوديوم عبر غرفة التدفق. مراقبة ارتباط خيوط الأكتين بالسطح تحت المجهر الفلوري بهدف 100x. تأكد من كثافة خيوط الأكتين المثلى للتتبع ، مع وجود خيوط كافية في مجال الرؤية ولكن متناثرة بما يكفي لمنع التداخل.
بعد ذلك ، اغسل غرفة التدفق بثلاثة أحجام حجرة من 150 مللي مولار لحركة كلوريد الصوديوم لإزالة خيوط الأكتين غير المرتبطة والرودامين فالودين الزائد. لبدء الحركة ، أضف حجم غرفة واحد من المخزن المؤقت النهائي إلى غرفة التدفق. بعد ذلك ، قم بتسجيل الصور على مجهر مضان باستخدام إثارة 561 نانومتر لتصور الأكتين المسمى بالرودامين والفالويدين.
ابحث عن منطقة على الشريحة بكثافة الأكتين المطلوبة والتقط الصور كل 30 ثانية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتنزيل البرنامج السريع وتثبيته من مستودع GitHub. تأكد من أنه الإصدار المتوافق مع Python 3 مع وحدة إضافية لتحويل ملف ND2.
قم بتشغيل البرنامج السريع باستخدام قيمة تفاوت 33 للاحتفاظ فقط بالخيوط المتحركة بسلاسة. بعد ذلك ، استخدم برنامج Fast لتحليل صور TIFF التي تم إنشاؤها حديثا. اضبط القيمة القصوى x على 20 ، 000 نانومتر والقيمة القصوى y على 20 نانومتر في الثانية لتمثيل أطول طول للفتيل وسرعة الفتيل القصوى.
بعد ذلك ، استخدم px لضبط حجم البكسل للصورة المكتسبة على 65 نانومتر. اضبط minV على 0.1 نانومتر في الثانية كحد أدنى للسرعة المطلوبة لإدراج الفتيل في التحليل. لتعيين الحد الأقصى للمسافة المسموح بها بين الإطارات لربط الخيوط ، استخدم maxD ، وتجنب ربط خيوط منفصلة بين الإطارات.
استخدم pt لضبط التسامح مع التقلبات في سرعات الفتيل ، بما في ذلك الخيوط ذات الحركات السلسة فقط. أخيرا، استخدم d للإشارة إلى المجلد الذي يحتوي على مكدسات TIFF للتحليل. أظهر اختبار انزلاق خيوط الأكتين الحركة البطيئة للميوسين 7a ، مع تسريع تشغيل الفيديو 500 مرة لتصور الحركة.
أظهر توزيع سرعة الميوسين -7 أ ذروة أقل من خمسة نانومتر في الثانية ، مما يؤكد بطء حركته.
