للبدء ، خذ خلايا U2OS المزروعة مع التقاء 60٪ إلى 70٪ وقم بتقسيمها باستخدام 0.25٪ Trypsin-EDTA. قم بإعداد ألواح 60 ملم عن طريق إضافة زلات غطاء مستديرة مقاس 13 ملم. لوحة 400 ، 000 خلية في صفيحة 60 ملم تحتوي على زلات غطاء دائرية متعددة مقاس 13 ملم.
ثم قم بإزالة وسط الثقافة من اللوحات. أضف وسط الثقافة الذي يحتوي على 25 ميكرومولار إيتوبوسيد ، واحتضن الخلايا لمدة 20 دقيقة و 1 ساعة و 3 ساعات. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسيط من اللوحات.
اغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات. لإصلاح الخلايا ، أضف الميثانول المثلج بحجم كاف لتغطية سطح انزلاق الغطاء ، واحتضانه لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل زلات الغطاء باستخدام PBS ثلاث مرات وانقلها إلى غرفة الرطوبة.
بعد النقر على PBS ، أضف 30 إلى 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت للنفاذية واحتضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم اضغط على PBS من العينات.
أضف 30 إلى 40 ميكرولترا من محلول الحظر الموجود في مجموعة PLA إلى كل زلة غطاء. احتضان اللوحة في غرفة رطوبة مسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. الآن قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية في مخفف الجسم المضاد الموجود في المجموعة.
بعد النقر على محلول الحجب ، أضف محلول الجسم المضاد الأساسي إلى كل زلة غطاء واحتضانه عند أربع درجات مئوية طوال الليل في غرفة الرطوبة. تمييع ناقص وزائد مجسات واحد إلى خمسة في مخفف الجسم المضاد. استخدم مجموعات مثل الحمار المضاد للفأر ناقص مع الحمار المضاد للماعز PLUS والحمار المضاد للفأر ناقص مع الحمار المضاد للأرانب PLUS.
الآن ، اضغط على محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسلها مرة واحدة باستخدام TBST. بعد التخلص من TBST الزائد ، أضف 20 ميكرولترا من محلول مسبار PLA إلى زلات الغطاء. ثم ، احتضن في غرفة الرطوبة المسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
قم بتخفيف المخزن المؤقت للربط 5x في ماء عالي النقاء. اضغط على محلول مسبار PLA واغسلها مرة واحدة باستخدام TBST. الآن ، أضف الليغاز إلى محلول الربط عند التخفيف 1:40 مباشرة قبل تطبيقه على العينات.
احتضن في غرفة الرطوبة المسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتخفيف مخزن التضخيم 5x في الماء عالي النقاء. بمجرد إزالة محلول الربط من العينات ، اغسل العينات مرة واحدة باستخدام TBST.
أضف البوليميراز إلى محلول التضخيم عند 1:80 تخفيفات مباشرة قبل تطبيقه على العينات. احتضن في غرفة الرطوبة المسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة. اضغط على المخزن المؤقت للتضخيم ، ثم اغسله مرتين باستخدام المخزن المؤقت SSC لمدة 10 دقائق لكل منهما.
بعد غسل العينات مرتين باستخدام PBS ، أضف محلول الجسم المضاد الأساسي إلى كل زلة غطاء واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. في نهاية الحضانة ، اضغط على محلول الأجسام المضادة الأولية واغسلها ثلاث مرات باستخدام TBST. بعد ذلك ، أضف محلول الجسم المضاد الثانوي إلى كل زلة غطاء واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك ، اغسل خمس مرات باستخدام TBST ، ومرتين باستخدام المخزن المؤقت SSC ، ومرتين باستخدام المخزن المؤقت SSC 0.01x. أخيرا ، احصل على صور من آبار مختلفة أو مناطق زلات الغطاء لتجنب القطع الأثرية بسبب الحضانة غير المتجانسة ، واحفظ جميع القنوات التي تحمل نفس نمط الاسم.
