للبدء ، قم بتسخين حاضنة حرارية عند 42 درجة مئوية. أضف ميكرولتر واحد من خلات المغنيسيوم ومزيج محلول أسيتات البوتاسيوم إلى جانب الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات RTRPA المجففة بالتجميد والممزوجة مسبقا. أعد تعليق الحبيبات في 12.4 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي.
لبدء تفاعل RTRPA ، قم بتدوير المحلول المضاف لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ثوان. اضغط بعناية على الأنبوب لخلط المحتويات جيدا وتدويرها مرة أخرى. احتضان التفاعل عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حاضنة اهتزاز حراري مسخنة مسبقا.
بعد انتهاء التفاعل ، قم بإزالة أنابيب التفاعل وضعها على الجليد قبل المتابعة إلى اكتشاف CRISPR-Cas. للكشف عن الحمض النووي، قم بتشغيل قارئ الألواح الدقيقة الفلورية. اضبط قارئ الألواح الدقيقة وقم بتسخينه مسبقا على 37 درجة مئوية وحدد البرنامج.
ثم ضع طبق 384 جيدا على الثلج. لإعادة تعليق تفاعل الكشف المسبق الخلط CRISPR-Cas المجفف بالتجميد ، أضف 17 ميكرولترا من محلول كلوريد المغنيسيوم المكون من ثمانية مللي مولار. امزج عن طريق النقر بعناية على الأنبوب.
قم بالدوران لفترة وجيزة لمدة ثلاث ثوان قبل وضع الأنبوب على الجليد. انقل 18 ميكرولترا من مزيج التفاعل المعلق إلى كل بئر من صفيحة البئر 384 المبردة مسبقا على الجليد. أضف ميكرولترين من منتج RPA المحضر لكل تفاعل جيدا.
قم بإزالة الطبق من الجليد. ضعه بسرعة في قارئ صفيحة مضان مسخن مسبقا واضغط على ابدأ. بالنسبة للتفاعلات المجففة بالتجميد والمختلطة مسبقا القائمة على Cas13a ، يحافظ إما 6٪ تريهالوز أو 2٪ سكروز على كفاءة التفاعل جيدا بعد التجميد بالتجميد.
الكواشف المجففة مسبقا للتفاعلات القائمة على RTRPA و Cas13 مستقرة عند 20 درجة مئوية لمدة ثمانية أشهر على الأقل.
