للبدء ، اجمع شتلات Columbia-0 Arabidopsis المجمدة المجهدة بالحرارة وغير المعالجة التي يبلغ عمرها خمسة أيام في حاوية النيتروجين السائل. طحن الشتلات باستخدام الخالط إلى مسحوق لمدة دقيقة واحدة. ثم أضف 500 ميكرولتر من مخزن استخلاص البولي سوم إلى الأنبوب.
اقلب الأنبوب وقم بدوامه لخلط العينة. جهاز الطرد المركزي لمحلول الاستخراج عند 12 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بتصفية المادة الطافية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر للحصول على محلول استخراج واضح وخالي من الجسيمات.
قم بتحميل المادة الطافية المفلترة على تدرج السكروز المعد مسبقا وانتظر حتى يصل إلى التوازن. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي الفائق التدرج باستخدام دوار دلو متأرجح عند 210 ، 000 جم لمدة 3.5 ساعة عند أربع درجات مئوية مع أقصى معدلات تسارع وتباطؤ. يتم فصل الحمض النووي الريبي غير متعدد الجذور ومتعدد الجذور بناء على كثافتها في محلول تدرج السكروز المقابل.
قم بإعداد محلول المطاردة لمضخة الحقنة ذات الحجم الصغير التي تتكون من 70٪ سكروز و 10٪ جلسرين و 0.02٪ بروموفينول أزرق. امزج المحلول جيدا لمدة 30 إلى 40 دقيقة. بعد حقن محلول المطاردة في التدرج ، باستخدام البرنامج ، تحكم في مجزأ تدرج الكثافة.
ثم قم بمعايرة الماكينة بالماء منزوع الأيونات. بعد الطرد المركزي الفائق ، ضع الأنبوب على مجزأ تدرج الكثافة. باستخدام نظام ثقب الأنبوب ، قم بتوصيل الأنبوب بمضخة الحقنة وكاشف الأشعة فوق البنفسجية.
قم بتبديل مجزأة تدرج الكثافة إلى جهاز التحكم عن بعد في وضع التحكم في البرنامج. اضبط معدل تدفق الحقن لمضخة الحقنة صغيرة الحجم على ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. ابدأ عملية الحصول على الرسم البياني لملف تعريف متعدد الجسيمات عن طريق قياس الكثافة الضوئية عند 254 نانومتر باستخدام المجزأ.
بناء على قياسات ملف تعريف متعدد الجسيمات ، اجمع كسور الحمض النووي الريبي غير متعددة الجذور ومتعددة الجذور بشكل منفصل. امزج أجزاء الحمض النووي الريبي المجمعة جيدا مع محلول عالي الملح مرتين قبل البرودة. ثم أضف ثمانية ميكرولترات من مخزون مخفف من التحكم في الحمض النووي الريبي بولي أ حقيقيات النواة من المجموعة.
جهاز الطرد المركزي المحلول عالي الملح يخلط الحمض النووي الريبي مع دوار دلو متأرجح عند 450 ، 000 جم لمدة خمس ساعات عند أربع درجات مئوية. اسكب المادة الطافية بعناية واغسل حبيبات الحمض النووي الريبي ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من الماء المعالج مسبقا ب DEPC. بعد الغسيل الأخير ، أضف 500 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي إلى عينة الحمض النووي الريبي.
تخلط وتحتضن لمدة 10 دقائق. أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم واخلطها جيدا. احتضن لمدة 10 دقائق للسماح بفصل الطور.
الطرد المركزي الخليط على حرارة 12 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل الطبقة المائية الصافية العلوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جديد واخلطها برفق بحجم متساو من الأيزوبروبانول. احتضان الخليط عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعتين لترسيب الحمض النووي الريبي.
بعد هطول الأمطار ، قم بجهاز الطرد المركزي مرة أخرى وتخلص من المادة الطافية ، تاركا حبيبات الحمض النووي الريبي في الأسفل. اغسل حبيبات الحمض النووي الريبي بملليلتر واحد من الإيثانول 75٪ قبل البرودة. جهاز طرد مركزي عند 12 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وجفف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء.
عند التجفيف ، أعد تعليق الحبيبات في 30 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي كامل الطيف عند 220 إلى 750 نانومتر ، مع التركيز على الكثافة الضوئية عند 260. أظهر التنميط متعدد الجسيمات فصلا واضحا بين الكسور غير المتعددة الجذور والكسور المتعددة الجذور في ظل الظروف العادية.
أدى الإجهاد الحراري عند 40 درجة مئوية إلى تقليل شدة إشارة الجزء المتعدد الجذور بشكل كبير ، وتم عكس هذا التأثير بعد ساعتين من التعافي عند 22 درجة مئوية ، مما أعاد الإشارة إلى مستويات التحكم. أشارت نتائج استخراج الحمض النووي الريبي إلى أن الإجهاد الحراري قلل من نسبة الحمض النووي الريبي في الجزء متعدد الصومال ، والذي تم استعادته بعد التعافي عند 22 درجة مئوية.
