تصميم sgRNA وبناء ناقل لتحرير الجينوم لتربية الأرز بالنشا المقاوم

للبدء ، انتقل إلى موقع NCBI على الويب لاسترداد الجين المطلوب من صنف Japonica Rice. قم بتنزيل الجينوم المرجعي والوصول إليه داخل برنامج الجينات SNAP. قم بتحليل عمليات الإدراج أو الحذف وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ضمن تسلسل exon ل O-S-S-B-E 2B من صنف X134 ، ومقارنته بالجينوم المرجعي.

باستخدام أداة NCBI primer blasts ، تصميم الاشعال ، وتحيط بمناطق exon. للتحقق من صحة تسلسل exon لجين O-S-S-B-E 2B في X134 عن طريق تسلسل Sanger ، قم بإعداد التفاعل وتشغيل برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل بالإعدادات المناسبة. صمم الحمض النووي الريبي المرجعي للدليل الفردي ، أو S-G-R-N-A على تسلسل إكسون O-S-S-B-E 2B ل X134 ، مع الالتزام بالبروتوكول ، وتأكد من أن تسلسل الشكل المجاور للفاصل الأولي هو TTN.

أضف CAC OLIGOS في الطرف الخمسة الرئيسي من التمهيدي الأمامي و GGCC OLIGOS في الطرف الخمسة الرئيسي من التمهيدي العكسي. بعد إذابة الاشعال ، امزج ميكرولتر واحد من كل برايمر مع ثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت الصلب. ضع المزيج في جهاز PCR وقم بتشغيل برنامج التلدين.

قم بتجميع S-G-R-N-A في متجه تحرير الجينوم وقم بتشغيل برنامج تجميع PCR. تحويل الناقل الناتج إلى خلايا الإشريكية القولونية ، وإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل على المستعمرات الفردية للكشف عن عمليات الإدراج الناجحة لتأكيد الاستنساخ الناجح باستخدام تسلسل سانجر.