وكان Vinculin - GFP البلازميد هدية من يامادا كينيث والمعاهد الوطنية للصحة ، المعهد الوطني للأبحاث الأسنان والجمجمة ، بيثيسدا بولاية ميريلاند ، وأكتين mRFP - البلازميد كان هدية من مايكل ديفيدسون ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي (فلوريدا). وأيد هذا العمل من قبل الجائزة شهادة NSF # 0747334 وAHA الجنسيات SDG # 0835205N لأندريا Trache.

1. نظرة عامة على النظام المتكامل مجهر وقد وصف النظام الذي يستخدم المجهر لهذه الدراسات بالتفصيل 1. باختصار ، هو الجمع بين مقلوب أوليمبوس التاسع - 81 مع مرفق TIRF المجهر (أوليمبوس ، ومركز وادي ، والسلطة الفلسطينية) مع CSU - 22 رئيس المسح يوكوجاوا (يوكوجاوا الكتريك المؤتمر الوطني العراقي ، اليابان). هي التي شنت Bioscope SZ مجهر القوة الذرية (Veeco أدوات المؤتمر الوطني العراقي ، وسانتا باربرا ، كاليفورنيا) على رأس المجهر المقلوب البصرية ، ويتم وضع النظام بأكمله على رأس جدول البحوث الصف الضوئي (نيوبورت ، إرفين ، كاليفورنيا). وترتبط بشكل صارم التجميع مبائر تتألف من الماسح الغزل القرص ، وعجلة تصفية الخارجية والكاميرا الخاصة به EMCCD (روبر العلمية لPhotometrics ، توكسون ، من الألف إلى الياء) مع قاعدة من الألومنيوم لوحة وضعت على منصة السيليكون اللازمة لتخميد الاهتزازات. الماسح مبائر يربط مع المجهر من خلال شفة مع ذوي الياقات البيضاء تتطاول التي يمكن فصله من خلال المجهر AFM القياسات ، مثل عدم وجود اهتزاز من الماسح الغزل القرص سوف يؤثر على قياسات فؤاد. يستخدم ليزر الأرجون ، الكريبتون (أطياف الفيزياء ، ماونتن فيو ، كاليفورنيا) كمصدر الإثارة لكلا TIRF وطرق التصوير مبائر ، وبدلا من ذلك يمكن أن يقترن في اثنين من الألياف البصرية التي توفر ليزر إلى المرفق TIRF أو مسح الرأس ، على التوالي . جهازي التحكم في النظام : Slidebook برنامج يتحكم في التصوير الضوئي وبرامج Nanoscope تسيطر على فؤاد. 2. خلية ثقافة ينبغي أن توضع الخلايا الحية معربا عن GFP يبني الموجهة ضد بروتينات معينة في طبق زجاج أسفل خلية ثقافة قبل 24 ساعة من التجربة تحفيز الميكانيكية. في يوم من التجربة محل مستنبت الخلايا الحمراء مع المتوسط ​​خالية من الفينول. هي التي شنت على طبق زراعة الخلايا على المسرح مع فؤاد طوق المغناطيسي. 3. فؤاد تلميح إعداد وتعيين مجهر المتابعة غيض فؤاد مكيفة مع ميكرون 2 biotinilated سيتم غسل الزجاج حبة خمس مرات مع DPBS ثم حضنت 5 دقائق مع أفيدين (1 ملغ / مل) ، وغسلها مرة أخرى مع خمس مرات DPBS ، ثم حضنت 5 دقائق مع 1 ملغ / مل biotinilated فبرونيكتين. وسيتم غسلها غيض خمس مرات أكثر في نهاية 2 ، التي شنت على الماسح الضوئي فؤاد ، ومن ثم سيتم وضع تنورة السيليكون وقائية حول حاملها. تعيين المجهر لمشاهدة الفيديو لمحاذاة الطرف فؤاد في مركز مجال الرؤية. محاذاة رافعة الضوئية من خلال وضع شعاع الليزر في نهاية جدا من ناتئ ، ثم تغيير الهدف إلى هدف تضخم عالية مناسبة لتصوير خلية واحدة. الربيع الدائم للطرف أن تحدد قبل بدء التجربة. وسوف يقاس هذه المعلمة باستخدام الأسلوب توليف الحرارية المتوفرة في البرنامج Nanoscope. التحول من كاميرا الفيديو إلى الكاميرا EMCCD للسماح للتصوير تنوير. ثم ، واختيار الخلية وجلب رأس فؤاد في اتصال مع تلك الخلية محددة. بعد 20 دقيقة وقت الانتظار ، وهو أمر ضروري للاتصال والتصاق قوي لتشكيل فؤاد عند نقطة اتصال مع سطح الخلية ، فإن الإجراء بدء التحفيز الميكانيكي. 4. الميكانيكية تحفيز الخلية الحية سوف TIRF التصوير 3-4 يكون الأسلوب المفضل لتصور وقياس الالتصاقات البؤرية ، وسيتم استخدام القرص الغزل مبائر التصوير (5) لتصور الهيكل الخلوي أكتين في جميع أنحاء الجسم الخلية. سوف تستخدم في التصوير فؤاد 6 وضع الاتصال في إطار السوائل. سيتم الحصول على صورة أو TIRF مبائر من الخلية قبل البدء في إجراءات التحفيز الميكانيكي. وسوف يكون ذلك حافزا لتحفيز الميكانيكية عن طريق المسبار AFM functionalized التي سيتم نقل التصاعدي في خطوات منفصلة كل دقيقة 3-5 على مدى فترة من الزمن (1-1،5 ساعات). سيتم تسجيل الخلية رد الفعل والاستجابة بشكل مستمر في البرمجيات Nanoscope على شكل سلسلة من الصور الارتفاع ، كل سطر في الصورة التي تمثل وحدة زمنية من 1 ثانية. في حين أن الحصول على البيانات فؤاد ، المشغل مراقبين في جميع الأوقات ض موقف الطرف فؤاد لتحديد التوقيت المناسب للسحب المقبل. بعد كل التحفيز الميكانيكي فمن الممكن الحصول على صورة أو TIRF مبائر للخلية في مجال البرمجيات Slidebook ، في حين أن الحصول على البيانات بشكل مستمر فؤاد. ويمكن معالجة الصور البصرية خارج الخط لخلق الأفلام التي تظهر الهيكل الخلوي أكتين التنسيق والتنظيم الالتصاقات. أيضا ، يمكن معالجة كل صورة كميا لتحديد منطقة الخلية ، ومنطقة محددة من البروتين ، وتحليل مورفولوجيا الخلايا العامة. وفي نهاية التجربة تم سحب غيض من فؤاد فؤاد الخلية ويمكن قياس حساسية طرف في البرنامج Nanoscope. تجربة حساسة جدا الضجيج! أي الحديث أو لمس خلال المجهر السابقينوينبغي تجنب periment. للحد من الضوضاء في قياسات AFM ، ينبغي مبائر الغزل قرص دي من جانب المجهر. ربما يكون الوقت في انتظار تشكيل التصاق قوي الاتصال بين سطح الخلية وغيض فؤاد تختلف تبعا لنوع من الخلايا المستخدمة والمغلفة مصفوفة على الحافة. 5. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تم تصوير الأوعية الدموية نفس الخلية العضلات الملساء (VSMC) transfected مع أكتين - mRFP وvinculin GFP من خلال : (أ) AFM على سطح الخلية القمي ، (B) TIRF على سطح الخلايا القاعدية ، و (C) الغزل القرص المجهري مبائر في جميع أنحاء الجسم الخلية. تظهر الصورة كما مبائر إسقاط الحد الأقصى لكومة 3 - D. وترد التداخل الجيدة بين فؤاد وTIRF الغزل أو القرص مبائر الصور في (D) و (ه) على التوالي. حجم الصورة هو 64 × 50 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. وقد حفزت ميكانيكيا VSMC transfected مع أكتين - mRFP من فؤاد والتقط بواسطة الغزل القرص المجهري مبائر تشير الأسهم إلى ألياف الأكتين ما يلي : (أ) تتبلمر / رشاقته ، (ب) يزيل البلمرة / تختفي ، أو (ج) بسبب ربطة معا إعادة هيكلة أكتين. بيضاء تمثل الخطوط المتقطعة غيض فؤاد فوق الخلية. حجم الصورة 91 × 91 ميكرون.

<ol>
	<li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells.">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).</li><li>Trache, A., Meininger, G. A., Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy.">Atomic Force Microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , 2.1-2.17 (2008).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Trache, A., Meininger, G. A., Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , 2.1-2.22 (2008).</li><li>Inoue, S., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-view+high-speed+confocal+scanner:+the+CSU-10.">Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10.</a> Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).</li><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope.">Atomic force microscope.</a> Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).</li><li>Stamenovi&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+mechanics+in+airway+smooth+muscle+cells.">Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells.</a> Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).</li><li>Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+remodeling+of+the+airway+smooth+muscle+cell:+a+mechanism+for+adaptation+to+mechanical+forces+in+the+lung.">Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).</li><li>Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganization+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins.">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).</li><li>Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+Adhesions:+paradigm+for+a+signaling+nexus.">Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus.</a> Circulation Research. 98, 606-616 (2006).</li><li>Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+development+during+contractile+stimulation+of+smooth+muscle+requires+recruitment+of+paxillin+and+vinculin+to+the+membrane.">Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).</li><li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction:+all+signals+point+to+cytoskeleton,+matrix+and+integrins.">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins.</a> Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).</li><li>Zamir, E., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+complexity+and+dynamics+of+cell-matrix+adhesions.">Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions.</a> J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).</li><li>Geiger, B., Bershdsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+mechanosensory+function+of+focal+contacts.">Assembly and mechanosensory function of focal contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).</li><li>Sastry, S. K., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+Adhesions:+a+nexus+for+intracellular+signaling+and+cytoskeletal+dynamics.">Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics.</a> Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).</li><li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mechanotransduction.">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Dev Cell. 10, 11-20 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

التصاقات الهيكل الخلوي 70-10 11-16 والتنسيق والهياكل الديناميكية التي تجميع وتفريق وتسليم وترحيل الخلايا أو الاستجابة لقوة ميكانيكية 17. لديهم وظائف كبيرة في تنظيم نمو الخلايا ، وبقاء ، والتعبير الجيني. معرفة التوزيع الخاصة بها وديناميكية توفر فهما أفضل لكيف...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AFM tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novascan Technologies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface</td>
</tr>
<tr>
<td>avidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A9275</td>
<td>1mg/mL in DPBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>F4759</td>
<td>1 mg/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21600-051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>VPI-1004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mattek glass bottom dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corporation</td>
<td>P60G-1.5-30-F</td>
<td>Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy

لفهم الآلية التي الخلايا الحية الشعور القوات الميكانيكية ، وكيف تستجيب وتتكيف مع بيئتها ، وهي تكنولوجيا جديدة قادرة على التحقيق في سلوك الخلايا الفرعية الخلوية عالية المستوى مع القرار المكانية والزمانية والمتقدمة. وهكذا ، تم دمج مجهر القوة الذرية (AFM) مع مجموع المجهري التأمل الداخلي (TIRF) مضان والقرص التي تدور بسرعة (FSD) المجهري متحد البؤر. منظومة متكاملة قابلة للتطبيق على نطاق واسع عبر طائفة واسعة من الدراسات الحيوية الجزيئية في الخلايا الحية أي ملتصقة ، مما يسمح التصوير الضوئي المباشر للاستجابات الخلايا لتحفيز الميكانيكية في الوقت الحقيقي. وقد أظهرت إعادة ترتيب كبيرة من شعيرات أكتين والالتصاقات البؤرية بسبب تحفيز الميكانيكية المحلية على سطح الخلية التي يسببها قمية تغييرات في الهيكل الخلوي في جميع أنحاء الجسم الخلية. وهذه التقنيات المبتكرة لتوفير معلومات جديدة فهم يعيشون إعادة هيكلة الخلية واستجابة لديناميات القوة الميكانيكية. بروتوكول بيانات مفصلة وممثل المجموعة التي ترد ردا تظهر الخلية الحية لتحفيز الميكانيكية.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

هذه الورقة تهدف إلى إرشاد القارئ في عملية متكاملة لقوة ذرية المجهر البصرية التصوير الميكانيكي لتحفيز الخلايا الحية في الثقافة. ويرد بروتوكول خطوة بخطوة. وقدم ممثل مجموعة البيانات التي تظهر استجابة الخلية الحية لتحفيز الميكانيكية.

يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

live-cell-response-to-mechanical-stimulation-studied-integrated

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Texas A&M Health Science Center. هذه الورقة تهدف إلى إرشاد القارئ في عملية متكاملة لقوة ذرية المجهر البصرية التصوير الميكانيكي لتحفيز الخلايا الحية في الثقافة. ويرد بروتوكول خطوة بخطوة. وقدم ممثل مجموعة البيانات التي تظهر استجابة الخلية الحية لتحفيز الميكانيكية.

Video: Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

وعلى النقيض من مرحلة التدخل التفاضلية المجهري التباين (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise damaging insults from becoming neurotoxic.  We have been studying a form of presynaptic plasticity that is interesting in part because it is expressed as a digital switching on and off of a presynaptic terminal s ability to release vesicles containing the neurotransmitter glutamate.  Here we demonstrate a protocol for visualizing the activity status of presynaptic terminals in dissociated cell cultures prepared from the rodent hippocampus.  The method relies on detecting active synapses using staining with a fixable form of the styryl dye FM1-43, commonly used to label synaptic vesicles.  This staining profile is compared with immunostaining of the same terminals with an antibody directed against the vesicular glutamate transporter 1 (vGluT-1), a stain designed to label all glutamate synapses regardless of activation status.   We find that depolarizing stimuli induce presynaptic silencing.  The population of synapses that is silent under baseline conditions can be activated by prolonged electrical silencing or by activation of cAMP signaling pathways.

Glutamatergic synapses can switch from an active mode to a silent mode. We demonstrate that presynaptic activity status in dissociated culture of rodent neurons is visualized using a fixable form of the FM1-43 dye to visualize active synapses and immunostaining with vGluT-1 antibody to visualize all glutamate synapses.

صامت Presynaptically الوصلات العصبية درس مع المجهر الضوئي

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

الجزئي الميكانيكية توصيف أنسجة الرئة باستخدام القوة الذرية الميكروسكوب

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

تحليل الخلايا السطحية التصاق إعادة عرض في الاستجابة للتوتر الميكانيكية باستخدام الخرز المغناطيسي

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

قياس امتصاص الجلوكوز والاستجابة لتحفيز الأنسولين في<em&gt; في المختبر</em&gt; مثقف الإنسان ميوتوبيس الابتدائية

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

مجهر القوة نتوء: أسلوب لتحديد حجم القوات المتقدمة بنتوءات الخلية

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the plant. Many sophisticated techniques have been developed to measure these properties; however, atomic force microscopy (AFM) remains the most convenient for studying cell wall elasticity at the cellular level. One of the most important limitations of this technique has been that only superficial or isolated living cells can be studied. Here, the use of atomic force microscopy to investigate the mechanical properties of primary cell walls belonging to the internal tissues of a plant body is presented. This protocol describes measurements of the apparent Young&#39;s modulus of cell walls in roots, but the method can also be applied to other plant organs. The measurements are performed on vibratome-derived sections of plant material in a liquid cell, which allows (i) avoiding the use of plasmolyzing solutions or sample impregnation with wax or resin, (ii) making the experiments fast, and (iii) preventing dehydration of the sample. Both anticlinal and periclinal cell walls can be studied, depending on how the specimen was sectioned. Differences in the mechanical properties of different tissues can be investigated in a single section. The protocol describes the principles of study planning, issues with specimen preparation and measurements, as well as the method of selecting force-deformation curves to avoid the influence of topography on the obtained values of elastic modulus. The method is not limited by sample size but is sensitive to cell size (i.e., cells with a large lumen are difficult to examine).

Studies of cell wall biomechanics are essential for understanding plant growth and morphogenesis. The following protocol is proposed to investigate thin primary cell walls in the internal tissues of young plant organs using atomic force microscopy.

توصيف الخواص الميكانيكية للجدار الخلوي الأولي في أعضاء النبات الحي باستخدام مجهر القوة الذرية

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...