Name: protrusion force microscopy: a method to quantify forces developed by cell protrusions
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions at JoVE.com

الكتاب ممتنون لانا لابيرنادي وغيوم Charrière وباتريك ديلوبيلي على مساهمتها الأولى لهذا العمل سانشيز ماتيو وفيلا فرانسواز لمساعدتهم بتصوير الفيديو وتحريرها. ودعمت هذا العمل تم بالوكالة الوطنية de la البحوث (ANR14-CE11-0020-02)، مؤسسة لبحوث ميديكال (FRM DEQ2016 0334894)، INSERM خطة السرطان وسرطان تولوز مؤسسة وبرنامج العلوم الحدود البشرية (RGP0035/2016).

1-إعداد الشبكات المغلفة فورمفار
<ol><li>تنظيف شبكات الميكروسكوب الإلكتروني مع الأسيتون النقي وتجفيفها على ورق الترشيح. ثم نظيف شريحة مجهر مع الإيثانول النقي، يمسح مع ورقة عدسة وإزالة الغبار مع منفاخ.</li>
	<li>مكان على شريحة زجاج تنظيفها الإيثانول عمودياً في القمع لجهاز صب الأفلام التي تتضمن حلاً فورمفار في الجزء السفلي. يغطي الجزء العلوي من القمع.</li>
	<li>ضخ 100 مل محلول فورمفار (0.5% في كلوريد الإيثيلين) مع لمبة رذاذ حتى يصل إلى المستوى الثلثين من الشريحة.</li>
	<li>ضع الشريحة في الحل لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>فتح الصمام الجهاز استنزاف الحل فورمفار في دفق مستمر. معدل تدفق من 10 إلى 15 مل/s سوف تسفر عن فيلم فورمفار من 30-80 نانومتر. يتم تحديد سمك الفيلم بتركيز حل فورمفار، ومعدل الصرف. ملاحظة: يمكن التحكم في سعر الصرف بواسطة التنفيس الضغط عن طريق صمام الهواء من خلال فتح ببطء الصمام. أسرع الصرف، وأكثر سمكا الفيلم. في الممارسة العملية، لأنه من الصعب التنبؤ بسمك الفيلم من معدل التدفق فورمفار، نحن إعداد عدة دفعات من الأفلام فورمفار ومراقبة سمكها حسب فؤاد (راجع الخطوة 2).</li>
	<li>إزالة الشريحة من الدائرة وجاف أنه دقيق على الورق مرشح لإزالة أي فورمفار السائلة.</li>
	<li>قطع مستطيل 20 مم × 50 مم من الفيلم فورمفار بشفرة حلاقة.</li>
	<li>ملء كوب ماء مقطر نظيفة ويغرق ببطء الشريحة عمودياً في الماء لتطفو قبالة الفيلم: الفيلم يجب أن تطفو على سطح الماء.</li>
	<li>مواجهة شبكات تنظيف الأسيتون الجافة مكان في الفيلم، لامعة.</li>
	<li>وضع زجاج جولة ساترة (Ø 12 مم) على عدد قليل من الشبكات. سيعمل هذا ساترة قياس سماكة الفيلم (راجع الخطوة 2).</li>
	<li>تغطية شريحة مجهر مع ملصق أبيض حجمها لتناسب ذلك. تراجع الشريحة عمودياً عند الحدود للفيلم فورمفار العائمة حتى الفيلم كله تلتزم بالشريحة. إزالة الماء الزائد من الشريحة مع ورق الترشيح وأتركها تجف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.</li>
</ol>2-قياس سمك الفيلم
<ol><li>قطع فورمفار حولها ساترة مع ملاقط لفصل فإنه من الشريحة.</li>
	<li>وضع علامة على موقع الشبكة تحت ساترة بقلم.</li>
	<li>قطع فورمفار حول الشبكة ملحوظ لفصل فإنه من ساترة. ولذلك ستكون ثقب في ورقة فورمفار المتبقية، والتي سوف تسمح لقياس سماكة الفيلم. تغطية ساترة مع برنامج تلفزيوني ووضعه على شريحة زجاج في المجهر.</li>
	<li>جبل ناتئ نيتريد سيليكون على كتلة الزجاج فؤاد، مع التأكد من أن الشريط الذهبي لا يشملها غيض من فصل الربيع. ملاحظة: حساسية وربيع ثابت ناتئ ينبغي أن يكون سابقا تم معايرة في برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>جبل كتلة الزجاج على الوحدة النمطية فؤاد ومن ثم وضع الوحدة النمطية على المجهر.</li>
	<li>ضع ساترة المغلفة فورمفار في دائرة المراقبة وتغطية ذلك مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>المسح الضوئي من الثقب في ورقة فورمفار استخدام فؤاد في وضع الاتصال ومجموعة قوة 0.5 nN نقطة الحدود.</li>
	<li>استخدام سطح الزجاج ساترة كالمرجع لقياس الطول، وتقييم سمك فورمفار كارتفاع المقطع العرضي (إجراء قياسات على الأقل 10 كل دفعة فورمفار).</li>
</ol>3-زرع الخلايا في الشبكات
<ol><li>تحت غطاء عقيمة، وضع شريطا (12 ملم × 3 ملم) من شريط لاصق الوجهين على ساترة.</li>
	<li>قطع شبكة فورمفار المغلفة بملاقط ووضعه رأسا على قطاع لاصقة (حافة الشبكة فقط يحتاج لإلحاقها بالشريط). الفيلم فورمفار يجب أن تواجه ساترة.</li>
	<li>وضع هذا الجهاز في ثقافة جيدا.</li>
	<li>مكان معالجة تجميعية 10 ميليلتر من ربمي دون FCS التي تحتوي على 104 الضامة متباينة من وحيدات الإنسان16. ملاحظة: تأكد من عدم اتصال الشبكة مع طرف الماصة لمنع إتلاف طلاء فورمفار.</li>
	<li>احتضان لمدة 30 دقيقة (37 درجة مئوية، 5% CO2) للسماح للخلايا الالتزام.</li>
	<li>تملأ البئر مع 2 مل ربمي المحتوية على السفح 10%.</li>
	<li>احتضان الجهاز ح 2 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 للسماح للخلايا الالتزام قبل المراقبة فؤاد.</li>
</ol>4-تضاريس قياسات التشوهات الناجمة عن بودوسومي
<ol><li>عصا الشريطين لتضاعف من جانب شريط لاصق على زجاج قاع طبق بيتري. ملاحظة: يجب أن تكون المسافة بين الشريطين أصغر من قطر الشبكة.</li>
	<li>فصل الشبكة مطلي بالضامة من الشريط اللاصق بعناية.</li>
	<li>تشغيل الشبكة رأسا من أجل الحصول على الخلايا التي يواجهها الزجاج وعصا الشبكة بين الشريطين لاصقة.</li>
	<li>إصلاح الشبكة مع اثنين شرائط جديدة من الضعف من جانب لاصق: الشبكة وبالتالي سوف يكون تقع بين الشريطين لاصقة، تاركاً المنطقة الوسطى من الشبكة موجوداً لنصيحة فؤاد. ملاحظة: تأكد من أن الشبكة الثابتة جيدا ولا الملتوية؛ ناتئ فؤاد قد لا تكون قادرة على الاقتراب من السطح فورمفار.</li>
	<li>ملء طبق بيتري مع 2 مل من قبل ساخنة في 37 درجة مئوية الثقافة المتوسطة (ربمي مع السفح 10 ٪) وتستكمل مع 10 ملم حبيس (درجة الحموضة 7.4).</li>
	<li>ضع الطبق الثقافة على سخان طبق 37 درجة مئوية.</li>
	<li>تثبيت سخان طبق في مرحلة فؤاد.</li>
	<li>السماح للنظام بتحقيق استقرار في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>في وضع الاتصال مع قوة 0.5 nN، جعل صورة عالمية أولى لتحديد موقع بودوسوميس، ومن ثم مسح طبوغرافية فورمفار عند 3 هرتز مع كسل نانومتر كبيرة حوالي 20. ملاحظة: تجنب المسح الضوئي قرب حواف الشبكة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate.">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype.">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification.">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease.">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li><li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration.">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li><li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Forces+in+Cell+Biology.">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li><li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes.">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343 (2014).</li><li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+Together:+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors.">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li><li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking.">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li><li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis.">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li><li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments.">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li><li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A.">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li><li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Macrophage+3d+Migration:+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration.">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Phosphorylation+of+Wiskott-Aldrich+Syndrome+Protein+(Wasp)+by+Hck+Regulates+Macrophage+Function.">Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).</li><li>Van Goethem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Podosomes+Go+3d.">Macrophage Podosomes Go 3d.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).</li><li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages:+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures.">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li><li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages.">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li><li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podosome+Force+Generation+Machinery:+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring.">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li><li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells.">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li><li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes.">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li><li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory/Effector+T+Cells.">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li><li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion.">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li><li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts.">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li><li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion.">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis.">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li></ol>

وأعلن لا تضارب في المصالح.

خصائص المواد
اختيار المواد للغشاء تشوه، في حالتنا فورمفار، يحتاج إلى الوفاء ببعض المتطلبات. المواد التي يجب أن تكون شفافة للضوء المرئي ويحمل الأسفار السيارات المحدودة للسماح للملاحظات في الميدان مشرق والفحص المجهري الأسفار. خشونة الفيلم رقيقة يجب أن تكون أقل من 1...

الخلايا الحيوانية التفاعل فعلياً مع المصفوفة والخلايا الأخرى التي تشكل هذه البيئة1. وهذا مطلوب بالنسبة لهم ترحيل أو تدخيل الهيئات، والحصول على المعلومات الخارجية أو التفريق. في مثل هذه العمليات، يجب إنشاء الخلية القوات الميكانيكية، وكما أظهرت العديد من الدراسات على مدى السنوات الأخيرة، قدرة خلية لتوليد القوى، والتحقيق في بيئتها يؤثر على سلوكها البيولوجي، على سبيل المثال توجيه الانتشار أو تمايز2،3. بدوره، قياس قوات الخلوية مساعدة كبرى دراسة تنظيم توليد القوة وفهم أثره في الخلايا والأنسجة والسلوك مصير4،5.
وقد شهدت السنوات الأخيرة تطوير العديد من التقنيات لقياس القوى التي يمكن أن تمارسه خلية على البيئة6. أن غالبية هذه قد ساعدت في الكشف عن قوي الجر أن تمارس الخلايا كما أنها تسحب متنقلة المسابير أو تشوه الركازة. بيد قوي ميكانيكية المتورطين في نتوء في البيئة خارج الخلية تعاني من الافتقار إلى تقنيات القياس والتاريخ تتميز ليس على ما يرام.
للتغلب على هذا التحديد، نقدم طريقة لقياس القوى التي تمارس أورثوجونالي إلى الركيزة. وهو يتألف في طلاء الخلايا الحية على ورقة رقيقة مرنة التي يمكن أن تشوه في اتجاه متعامد، مما يجعل من الممكن لقياس التشوه الركيزة بالخلايا ونستنتج القوى المعنية. يقاس الطوبوغرافيا الركازة مع القرار النانو باستخدام مجهر القوة الذرية والتقييم للقوات من التشوه ويعتمد على معرفة هندسة الهياكل الخلوية بارزة7،8، 9.
هنا، نحن وصف الإعداد وتطبيقها لقياس القوى التي تم إنشاؤها بواسطة بودوسوميس، هياكل التصاق بارزة شكلتها الضامة لهجرتهم الوسيطة في بيئات ثلاثية الأبعاد10،11، 12،13،،من1415،،من1617. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب ستعزز التفاهم وتوليد القوة وتنظيمها في العديد من العمليات الخلوية التي تنطوي على نتوء.

<table><tbody><tr><td>200 mesh nickel grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>White stickers 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Film casting device with valve in its outlet</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Razorblades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm coverslips</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Temperature-controlled sample holder&amp;nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Double-sided adhesive tape</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

protrusion force microscopy: a method to quantify forces developed by cell protrusions

في العديد من السياقات البيولوجية، تحتاج الخلايا الحيوانية من التفاعل فعلياً مع بيئتها بتطوير القوات الميكانيكية. ومن بين هذه الجر قوات كانت تتسم جيدا، ولكن هناك نقص في التقنيات التي تسمح بقياس بروز قوي تمارسه الخلايا أورثوجونالي إلى هذه الركيزة. لقد قمنا بتصميم إعداد تجريبية لقياس بروز قوي تمارسه الخلايا ملتصقة على هذه الركيزة. خلايا مطلي على ورقة فورمفار متوافقة مع تشوه هذه الركيزة وهو تعيين التضاريس الناتجة عن ذلك بواسطة مجهر القوة الذرية (AFM) بمقياس نانومتر. ثم يتم استخراج قيم القوة من تحليل الشخصية تشوه استناداً إلى هندسة الهياكل الخلوية بارزة. ومن ثم، يمكن قياس قوي تمارسه الوحدات الفردية بارزة من خلية حية على مر الزمن. وستمكن هذه التقنية دراسة توليد القوة وتنظيمها في العديد من العمليات الخلوية التي تنطوي على نتوء. وهنا يصف لنا تطبيقه لقياس قوي بارزة المتولدة عن بودوسوميس التي شكلتها الضامة البشرية.

البروتوكول أعلاه توضح كيفية إعداد الإعداد التجريبية تحديد حجم القوات نتوء تطبقها بودوسوميس بلعم على الركازة فورمفار. وهذا يتحقق باستخدام فؤاد ويتضح في الشكل 1.
عند تحليل صورة طوبوغرافية تضخمات تحت بودوسوميس باستخدام برن...

Watch this Scientific Journal Video about Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions at JoVE.com

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

هنا، نحن بالتفصيل الأساليب التجريبية المستخدمة لتقييم قوي نتوء بودوسوميس تنطبق على فيلم متوافقة، من إعداد الفيلم للتحليل الآلي للصور الطبوغرافية.

مجهر القوة نتوء: أسلوب لتحديد حجم القوات المتقدمة بنتوءات الخلية

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

protrusion-force-microscopy-method-to-quantify-forces-developed-cell

Research

JoVE Journal

Biology

5.5K Views.  IPBS, Université de Toulouse, CNRS, UPS. هنا، نحن بالتفصيل الأساليب التجريبية المستخدمة لتقييم قوي نتوء بودوسوميس تنطبق على فيلم متوافقة، من إعداد الفيلم للتحليل الآلي للصور الطبوغرافية.

Video: Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Bioengineering

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous with the cytoskeleton, methods are needed to probe its mechanical behavior in adherent cells. Here, we discuss the direct force probe (DFP) as a tool to apply force directly to the nucleus in a living adherent cell. We attach a narrow micropipette to the nuclear surface with suction. The micropipette is translated away from the nucleus, which causes the nucleus to deform and translate. When the restoring force is equal to the suction force, the nucleus detaches and elastically relaxes. Because the suction pressure is precisely known, the force on the nuclear surface is known. This method has revealed that nano-scale forces are sufficient to deform and translate the nucleus in adherent cells, and identified cytoskeletal elements that enable the nucleus to resist forces. The DFP can be used to dissect the contributions of cellular and nuclear components to nuclear mechanical properties in living cells.

In this protocol, we describe a micropipette method to directly apply a controlled force to the nucleus in a living cell. This assay allows interrogation of nuclear mechanical properties in the living, adherent cell.

تحقيق قوة مباشرة لقياس التكامل الميكانيكية بين النواة وسيتوسكيليتون

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Biochemistry

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular stress and traction generation is currently unknown. Therefore, we present here a mechanics-based protocol to probe the influence of gap junction connexin 43 (Cx43) has on endothelial biomechanics by exposing confluent endothelial monolayers to a known Cx43 inhibitor 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) and measuring the impact this inhibitor has on tractions and intercellular stresses. We present representative results, which show a decrease in both tractions and intercellular stresses under a high chalcone dosage (2 &#181;g/mL) when compared to control. This protocol can be applied to not just Cx43, but also other gap junctions as well, assuming the appropriate inhibitor is used. We believe this protocol will be useful in the fields of cardiovascular and mechanobiology research.

Here, we present a mechanics-based protocol to disrupt the gap junction connexin 43 and measure the subsequent impact this has on endothelial biomechanics via observation of tractions and intercellular stresses.

الميكانيكا الحيوية المبطنة عن طريق الاضطرابات الهيكلية 43

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

ميكانيكا خلية السبر مع ملاقط خالية من حبة الضوئية في الجنين المورفولوجية

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Developmental Biology

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

قياسات القوة المباشرة للميكانيكا دون الخلوية في الحبس باستخدام ملاقط بصرية

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية باستخدام مزيج من التقنيات الفلورسنت

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

دراسة الهيكل الخلوي أكتين في الخلايا البطانية لايف تعرب عن GFP - أكتين

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

تصنيع وتنفيذ منصة المجهر قوه السحب المرجعية الحرة

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

الجر قوة المجهر لدراسة B تنشيط الخلايا الليمفاوية

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

توليد النمط لمجهر الجر المجهري

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...