Wir möchten Iwan Schie und Sebastian Wachsmann-Hogiu für ihre Beiträge bei der Entwicklung der DR-CARS-Technik. Tyler Wochen dankt für die Unterstützung durch die Lawrence Scholar Program von Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser ist dankbar für Unterstützung durch die American Heart Association durch die Grant-in-Aid-Programm. Diese Arbeit wurde zum Teil auch aus Mitteln der National Science Foundation unterstützt. Das Zentrum für Biophotonik, ein NSF Science and Technology Center, wird von der University of California, Davis gelungen, unter Cooperative Agreement Nr. 0120999 PHY. Unterstützung wird auch von der UCD Clinical Translational Science Center unter dem Förderkennzeichen UL1 RR024146 vom National Center for Research Resources (NCRR) anerkannt.

1. Generation von Autos und DR-CARS-Signale Zur Erzeugung CARS und DR-CARS-Signale gleichzeitig, drei einstellbare und synchronisiert kurz gepulsten Laserquellen erforderlich sind. <ol><li> Um drei synchronisierten Impulse beginnen wir mit einer Einzeldosis von 10 W Laser (PicoTrain, HighQ-Laser, Inc.). Dieser Laser hat eine feste Wellenlänge von 1064 nm, eine feste Pulsdauer von 7 ps und einer festen Repetitionsrate von 76 MHz. </li><li> Mit einer Reihe von Halbwellen-Platten und polarisierende Strahlteilerwürfel des Strahls in drei Teile aufgeteilt ist. Ein Halbwellenplatte mit einer polarisierenden Strahlteilerwürfel kombiniert ermöglicht es uns, die Menge an Energie in jeder Komponente des Strahls einstellen, ohne seine Richtung. Typischerweise werden zwei Strahlen auf ~ 4,5 W jeweils angepasst, und der dritte Strahl enthält die restlichen 1 W. </li><li> Die beiden Hochleistungs-Strahlen werden dann in zwei unabhängige optische parametrische Oszillatoren (OPO ist, Avante, APE GmbH, Berlin, Deutschland) geleitet. OPO die Nutzung Differenzfrequenz Generation auf ein höheres Energieniveau Photon in zwei Photonen von niedrigerer Energie umwandeln mit unterschiedlichen Wellenlängen. Durch die Steuerung der Temperatur des Kristalls verwendet werden, um diesen Effekt zu erzielen, können die Wellenlängen der entstehenden Photonen auf 0,1 nm gesteuert werden. Durch Frequenzverdopplung diesen Signalen ein Laser mit einer festen Wellenlänge von 1064 nm kann nun in einen Laserstrahl, der irgendwo zwischen 780 nm bis 910 nm abgestimmt werden verwandelt werden. Durch Pumpen zwei separate OPO ist mit der gleichen 1064 nm Quelle, erhalten wir zwei unabhängig abstimmbaren Laserquellen, die automatisch an unserer ursprünglichen Pumplaser synchronisiert sind. </li><li> Die dritte (niedrigste Leistung) Strahl aus der 1064 nm Pumplaser ist rund um die OPO ist durch eine Kombination von dichroitischen Spiegeln, so dass alle drei Strahlen (2 aus dem OPOs, 1 aus dem Pumplaser) später wieder zusammengeführt werden können gerichtet. Um effizient zu produzieren kohärente Raman-Signal Photonen der rekombiniert Impulse müssen sowohl zeitlich als auch räumlich überlagert werden. Da OPO Ring Hohlräume enthalten, so dass jeder Laserpuls durch den Kristall mehrfach übergeben, die Balken durch die OPO Reise-sandte einen zusätzlichen Abstand was zu einer erheblichen Verzögerung gegenüber dem ursprünglichen Pumpstrahl. Dieser Abstand muss mit dem dritten Strahl werden durch die Einführung von zusätzlichen Spiegeln, dass dieser Strahl auf den gleichen Abstand wie die beiden anderen zu reisen, bevor sie wieder zusammengeführt werden mit dichroitischen Spiegeln Kraft kompensiert. </li><li> Um die Feineinstellung der Länge des Weges jeder Strahl reist einstellbarer Verzögerung Stufen, mit Prisma Retroreflektoren sind in jedem Strahlengang eingebracht sind. </li><li> Ein weiterer Satz von Halbwellenplatten und polarisierenden Strahlteiler Würfel sind zu jedem Balken hinzugefügt, damit wir die Leistung der einzelnen Strahl unabhängig, ohne die Eingabe des OPO ist anzupassen. </li><li> Dichroitische Spiegel werden verwendet, um erste Mähdrescher die Strahlen aus den beiden OPO und dann mit der 1064 nm Strahl. Es muss darauf geachtet, um sicherzustellen, dass die Strahlen genau überlappen (dh sie sind kollinear und haben ähnliche Divergenz) werden. Dies kann durch den Vergleich der Überlappung der Balken in der Nähe (innerhalb von ein paar Zentimeter) und weit davon entfernt (ca. 1 m) der dichroitische Spiegel überprüft werden. </li><li> Der Vorteil der Verwendung von gepulsten Lasern ist, dass jeder Impuls kann eine hohe Spitzenleistung Energie bei der Probe haben, so dass für eine effiziente Erzeugung kohärenter Raman-Signale, unter Beibehaltung einer niedrigen durchschnittlichen Intensität. Eine hohe durchschnittliche Intensität kann zu einer Beschädigung der Probe. Deshalb, um weitere Kontrolle der durchschnittlichen Intensität, ohne dabei den Höhepunkt der Energieproduktion, sind die drei kombinierten Strahlen durch einen elektro-optischen Modulator (Pockels-Zelle, ConOptics) Funktion als Pulspicker, die uns auf die Wiederholrate der Impulse, die zu justieren geschickt kommen zu unserer Stichprobe und damit die durchschnittliche Intensität. </li><li> Die kombinierte Laserstrahlen werden dann in einem inversen Mikroskop mit einer hohen NA Ziel gekoppelt. Das Ziel ist in der Regel eine 60 X Wasser Objektiv mit einer numerischen Apertur (NA) von 1,2, dass die chromatische Aberration wurde über den Bereich der Einstellbarkeit unserer OPO und der 1064 nm Strahl korrigiert. Die enge Fokussierung durch die hohe NA Objektiv erzeugt ermöglicht die effiziente Erzeugung von kohärenter Raman-Signale auf der Mikrometer-Skala. </li><li> Die kombinierte Strahlen erweitert, um die Back-Port des Mikroskop-Objektivs überfüllen. Durch Überfüllung der Rückseite des Mikroskop-Objektivs erreichen wir die beste Fokussierung Bedingungen und sind daher die beste räumliche Auflösung in unserem Mikroskop-System. </li><li> Das Objektiv in unserem Mikroskop basiert auf einem XYZ Piezo-Bühne, die uns Bilder von Raster-Scan-Balken über der Probe, ähnlich wie bei kommerziellen Strahl-konfokalen Mikroskopen erhalten können montiert. </li></ol> 2. Die Verwendung von drei Short gepulsten Lasern Die Verwendung von drei kurzen gepulsten Lasern führt zur Produktion von mehreren CARS-Signale aus den verschiedenen combinations von zwei Lasern sowie 3-Color CARS und DR-FWM-Signale aus der Kombination von allen drei Lasern. <ol><li> Die Wellenlängen der Signale kann spektral nahe beieinander liegen. Wenn die Signale nahe beieinander sind, kann es schwierig sein, sie für die Analyse mit festen Wellenlänge Bandpass-Filter und dichroitische Spiegel zu trennen. Aus diesem Grund unsere Signale werden in einem bildgebenden Spektrometer (SpectraPro 2300i, Acton Research), der auch als eine effiziente Monochromator räumlich getrennte Signale bei verschiedenen Wellenlängen weitergegeben. </li><li> Ein elektronisch betätigte Klappspiegel innerhalb des Spektrometers in der abgesenkten Position sendet das Signal an einen Back-beleuchteten tief-Depletion charge-coupled device (CCD)-Kamera, die spektroskopische Information bietet über den gesamten Signalbereich und erlaubt uns, zu identifizieren und optimieren die verschiedenen kohärente Raman-Signale. </li><li> So wählen Sie das Signal, mit denen wollen wir Bild, das wir drehen Sie einfach das Gitter im Spektrometer, mit dem vom Anbieter bereitgestellten Steuerung und Datenerfassung (WinSpec, Princeton Instruments), zum Zentrum der Spitze der Zinsen auf die CCD-Kamera und ändern Sie dann die Position der Klappspiegel, dieses Signal zu einem zweiten Ausfahrt Port, an den Ein-Photon-Counting-Lawine Fotodiode (APD) angefügt wurde umgeleitet. </li><li> Das Objektiv wird dann Raster-gescannt und die Signale auf dem APD erfasst werden verwendet, um ein Bild, indem sie die Photonen-Zählrate für jedes Pixel über Datenerfassungs-Software (SymPhoTime, PicoQuant GmbH, Berlin, Deutschland) zu generieren. </li><li> Wir wiederholen dieses bildgebenden Verfahrens für jede gewünschte kohärente Raman-Signal, das uns die Signale während der Nachbearbeitung zu vergleichen. </li></ol> 3. Probenvorbereitung Um klare und reproduzierbare Bilder zu erhalten einige Vorsicht bei der Vorbereitung der Probe entnommen werden. <ol><li> Die Proben werden in der Regel auf ~ 150 Mikrometer dicken Deckgläser vorbereitet. Diese Deckgläser sind dünn genug, um für die hochauflösende Bildgebung mit der 1,2 NA Ziele, die typischerweise verwendet werden können. </li><li> Optische Einfangen von dielektrischen Objekten kann auftreten, wenn das Laserlicht gebeugt wird durch kleine transparente Objekte. Der Einsatz von gezielter, hoher Spitzenleistung, können kurz gepulsten Laserstrahlen ziehen kleine Zellen oder Bakterien an, was zu verschwommen oder verschmiert Bilder. Um dies zu vermeiden, kann es notwendig sein, um die Probe auf die Oberfläche des Deckglases immobilisieren, indem zunächst eine dünne Schicht aus Poly-L-Lysin durch Spin-Coating. </li><li> Für Zellen in Kultur Glasboden Kulturschalen genutzt, die es für die Bildgebung, ohne dass die Zellen aus ihren Zellkulturen Wachstum Gerichte zu lösen sein. </li><li> Zur Demonstration in diesem Beitrag haben wir die erste Einzahlung eines Formaldehyd-fixierten C. elegans Fadenwurm auf einem Deckglas. </li><li> Dann fügen Sie eine 20 uL Tropfen 5 M deuterierte Glucose-Lösung, um den Wurm. Die deuterierte Glucose-Lösung bietet eine einzigartige und starke Raman Hintergrund Signatur. </li></ol> 4. Probenanalyse Um richtig nutzen die doppelt resonante Verstärkung Effekt der Raman-Spektren der beiden Raman-Resonanz-Stoffe bekannt sein. <ol><li> Sobald die Probe wird auf dem Deckglas wird analysiert, mit einem konfokalen Raman-Mikroskop auf die maßgeblichen spontane Raman-Spektrum zu erhalten und geeignete Gipfel vorbereitet. </li><li> Um DR-CARS identifizieren wir die spektralen Lagen der CH Stretch-Modus, in der Regel mit Lipiden assoziiert, und die CD Stretch-Modus, im Zusammenhang mit dem deuterierten Glukose, um 2845 cm -1 und 2121 cm -1 bzw. werden. </li><li> Coherent Raman-Streuung ist erreicht, wenn die Frequenzdifferenz zwischen zwei Laser entspricht der Frequenz einer molekularen Schwingung. Durch die Abstimmung ein OPO bis 817 nm wird die Sonde 2845 cm -1 CH-Modus, wenn mit der 1064 nm Laserstrahl und durch Abstimmung der anderen OPO bis 868 nm wird es den 2121 cm -1 Peak-Sonde, wenn sie mit der 1064 nm Strahl kombiniert kombiniert . </li><li> Mit Raster-Scan der Probe auf dem CARS-Mikroskop wir jetzt beobachten können drei zusammenhängenden Raman-Signale von Interesse. A CARS-Signal Sondierung der CH-Valenzschwingung, signalisieren eine CARS Sondieren der CD Stretch-Modus, und ein DR-CARS-Signal Sondierung beide. </li><li> Wir wählen jeden Peak, wie in Abschnitt 2.3 beschrieben und nehmen Sie ein Bild wie oben beschrieben. </li></ol> 5. Image Processing Extrahieren zusätzliche Informationen über diese drei Bilder basieren erfordert nun einige ziemlich einfache Bildbearbeitung. <ol><li> Zunächst müssen die Bilder normalisiert werden. In der Theorie Normalisierung kann durch Berücksichtigung der Intensität der einzelnen Laser in jedes Signal Generation beteiligt erreicht werden. In der Praxis wird jedoch diese nicht immer funktioniert, vor allem aufgrund der uneinheitlichen spektrale Empfindlichkeitder dichroitische Spiegel, Detektoren und Gitterroste. </li><li> Eine praktische Methode zur Normalisierung beruht auf der Tatsache, dass in Regionen, in denen reine Lipide dominieren das Signal, das CD-Resonanz sollte keiner der das Signal beitragen. Ebenso in den Regionen der reinen Glucose-Lösung der CH-Resonanz sollte keiner der das Signal beitragen. In diesem Sinne, normalisieren wir die DR-CARS Bild und die CARS Bild auf dem CD-Resonanz des deuterierten Glukose-Lösung zu einer Region auch außerhalb der C erhalten elegans-Wurm, der keine CH-Resonanz zeigen sollte. </li><li> Dann ermitteln wir eine Region innerhalb der Wurm in der CH-Resonanz-CARS Bild, das reich an Lipiden und normalisieren sie die entsprechende Region in der normierten DR-CARS Bild. Für diese Methode richtig funktioniert wir annehmen, dass tief in dieser Region keine deuterierten Glukose vorhanden ist. Dies ist eine sichere Annahme, da die Lipide hydrophob sind und nicht mit der Lösung zu vermischen. </li><li> Jetzt, durch Subtraktion der normierten CH-Resonanz-CARS Bild aus dem normalisierten DR-CARS Bild sind wir nur mit dem verstärkten CD-Resonanz-Signal links. </li><li> Ebenso durch Subtraktion der normierten CD-Resonanz-CARS Bild aus dem normalisierten DR-FWM Bild sind wir nur mit dem verstärkten CH-Resonanz-Signal links. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung der DR-CARS-Mikroskopie-System wie oben beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Weißes Licht Bild einer C. elegans Wurm in deuterierten Glukose-Lösung auf einem Deckglas vorbereitet und bereit für die Bildgebung. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3:. Raman-Spektrum des modifizierten Ölsäure (eine ungesättigte Fettsäure), dass ein Alkin Modifikation (ein Kohlenstoff-Dreifachbindung Kohlenstoff-Gruppe) umfasst die starke CH-Resonanzen bei 2845 cm -1 und die Alkin-Resonanz bei 2100 cm -1 sind beide auch von der Fingerprint-Bereich (der Bereich von dicht gepackten Peaks) isoliert, wodurch sie ideal Marker für eine kohärente Raman Imaging. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4:. Typisches Spektrum kohärenter Raman-Signale generiert, wenn drei Kurzzeit-gepulste Laser in der Probe überlagert sind Die Pfeile zeigen auf den Prozess (es) für jedes Signal, wie Energie-Diagrammen dargestellt. In den Diagrammen hier gezeigten gestrichelten Pfeile Photonen aus dem Laser und der OPO-und durchgezogene Pfeile zeigen die resultierende Signal. Die durchgezogene horizontale Linien geben die Energie der Raman Vibrationen und geben eine visuelle Darstellung, dass DR-CARS, das Mischen der gleichen 3-Eingang Photonen gleichzeitig zwei verschiedene Sonden-Raman-Schwingungen. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5: Typische Ergebnisse von bildgebenden C. elegans Würmer mit DR-Autos und Fahrzeuge. Die oberste Zeile verwendet die drei Signale in Abbildung 4 dargestellt, um Bild ein Wurm in einer Lösung von deuterierten Glukose. In der zweiten Reihe wurden die Bilder entsprechend normalisiert und in der dritten Reihe die Differenz Bilder wurden durch Subtraktion jeder der CARS Bilder aus dem DR-CARS Bild produziert.

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	<li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li><li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+(CARS).">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li><li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions.">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li><li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+(DR-FWM).">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li><li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting.">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li></ol>

Raman-Spektroskopie und Raman-basierten Imaging sind mächtig aufstrebenden Werkzeuge in der Bio-Wissenschaften. Derzeit ist dies insbesondere für die in vivo und in vitro-Studie des Zellstoffwechsels und Stoffwechselstörungen in der Verarbeitung und Lagerung von Lipiden. Die meisten Bio-Makromolekülen enthalten eine große Anzahl von ähnlichen, meist Kohlenstoff basierenden molekularen Bindungen, so dass die Raman-Spektren von Zellen und Organismen gewonnen sind typischerweise eine Faltung der Beiträge aus Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Zucker, etc. sind Lipide relativ einfach Aus diesen komplexen Spektren zu isolieren, die aufgrund ihrer Neigung zu dichten Tröpfchen oder Lipid-Doppelschichten bilden, und weil sie enthalten lange Ketten mit einer großen Anzahl von aliphatischen CH-Bindungen. Unsere Fähigkeit, spezifische Proteine, Aminosäuren, RNA oder DNA innerhalb der komplexen zellulären Umgebung zu isolieren ist jedoch sehr begrenzt. Dies gilt insbesondere, wenn diese Moleküle von Interesse nur anwesend uM Konzentrationen und unten sind. Hier bietet die Möglichkeit, schwache Raman-Resonanzen Nutzung unserer neu eingeführten DR-CARS Unterschied bildgebendes Verfahren Sonde eine potentiell mächtige Ansatz für ihre chemische Mikroanalyse und Bildgebung. Zwar ist die komplizierteste Teil dieses Protokoll die Ausrichtung und die Synchronisation des Lasersystems. Beim Start aus dem Nichts, die Synchronisation der Impulse, dh der Sicherstellung, dass die Impulse in der Zeit sind trotz der unterschiedlichen Wege, die sie ergreifen können durch die Verwendung eines Impulses Autokorrelator erleichtert werden überlagert. Sobald räumliche und zeitliche Überlappung erreicht wird, CARS und DR-CARS-Signale sollten leicht nachweisbar. Allerdings ist die erste Ausrichtung oft roh, was zu schwachen Signalen. Die Best Practice für die Ausrichtung dieses System gut ist es, zunächst erzeugen schwache Signale und dann die Signalstärke, indem Sie vorsichtig die Feinabstimmung des Spiegel entlang jeder Pfad und die Anpassung der zeitlichen Überschneidung mit den Verzögerungsstufen zu verbessern. Obwohl das Spektrometer / Monochromator wirkt wie eine sehr effiziente Schallwand für Raumlicht die saubersten Ergebnisse durch den Betrieb des Systems mit der Raumbeleuchtung erreicht werden kann, ausgeschaltet und die Vorhänge oder Objektiv-Schlauch in den Hintergrund durch die verschiedenen anderen Lichtquellen (zB Computer-Monitoren eingeführt zu minimieren, Anzeige leuchtet, LEDs, etc.). Unsere speziellen Setup nutzt Single-Photon-Counting-Lawine Fotodiode (APD)-Detektoren und zeitlich korreliert Single Photon Counting (TCSPC) Hardware für den Nachweis 5. Dies ermöglicht es uns, extrem schwache Signale mit relativ geringem Rauschen, aber viele Gruppen haben Photomultiplier-Röhren (PMT) mit variabler Verstärkung von Vorteil, wenn bei ähnlichen Messungen gefunden zu erkennen. Der Vorteil von PMT ist, dass sie mit variablem Verstärkungsfaktor bieten und haben einen viel größeren Erfassungsbereich, die Ausrichtung des Detektors vereinfachen können. Darüber hinaus nutzt unser Setup Piezo-Stufen, um das Ziel zu übersetzen, um Strahlschwenkung zu erreichen. Der Vorteil davon ist, dass wir die Fähigkeit, sich an jeder beliebigen Stelle innerhalb der zuvor gescannten Bild zurück mit einem hohen Maß an Genauigkeit und nehmen zusätzliche Messungen einschließlich spontaner Raman-Spektren haben. Andere Gruppen waren erfolgreich nutzen Scanspiegel Baugruppen oder sogar ganze konfokalen Scanning-Einheiten wie den Olympus FluoView System, das viel schneller Bildgebung bietet aber in seiner Fähigkeit, genau an beliebige Orte zurückzukehren innerhalb eines Bildes begrenzt. Tuning der Laser passend zum Raman-Resonanz ist auch ein entscheidender Schritt, dass einige Optimierungen erfordern. Obwohl der Raman-Peaks die maximale spektrale Peak-Intensität von DR-Autos und Fahrzeuge erhalten erkennen kann, nicht unbedingt das Maximum der spontanen Raman-Peak entspricht. Dies ist auf die intrinsische Beeinflussung der Signale durch Vierwellenmischung führt zu einer nicht-resonanten Hintergrund-Signal und Autos, die CARS-Spektren relativ zur spontanen Raman-Spektren verzerrt generiert. Die spektrale Lage der Spitze des CARS-Signals berechnet werden, sondern ein praktischer Ansatz ist, die OPOs in mehreren, kleinen spektralen Schritte über die erwartete Lage der Raman-Resonanz-Melodie. Dieser Prozess sollte Ertrag ein deutliches Maximum. In der Tat, für die größte Empfindlichkeit von DR-FWM beiden Resonanzen muss zu diesem Maximum eingestellt werden. Eine letzte mögliche Problem der DR-CARS Ansatz muss auch diskutiert werden, dh die DR-CARS-Signal wird auf eine homogene Verteilung der Raman-aktiven Verstärkung Molekül ab. Für die meisten biologischen Objekten, könnte dies auch der breiten OH-Resonanz von Wasser, das reichlich und fast allgegenwärtig ist. Wasser ist jedoch aus hydrophoben Regionen mit einer Zelle, wie Fetttröpfchen, was zu einer Verzerrung der Signale erreicht, wenn mit dem Wasser Resonanz auf Lipid-Modi verstärken ausgeschlossen. In unserem Beispiel haben wir eine Lösung von deuterierten Glukose verwendet, um eine leicht erkennbare und reichlich Signal für unsere biologischen Probe zu erzeugen. Ebenso deuteriertem Wasser oder deuterierten biologischen buffers, wie d-HEPES verwendet werden könnte. In unserem Beispiel Tröpfchen der Lipid innerhalb der C. elegans Wurms waren klein genug, um immer enthalten sowohl die deuterierte Glucose-Lösung und Lipiden innerhalb der fokussierten Laserspot unseres Systems. Dies ist jedoch in der Regel nicht wahr. Ein besonderes Beispiel würde Adipozyten, die ziemlich großen Fetttröpfchen erzeugen in ihrem Zytoplasma werden. Dies bedeutet, erfordert jedes Experiment mit dem DR-CARS-Technik durchgeführt sorgfältige Vorbereitung und Kontrolle Experimente, um die Ergebnisse zu überprüfen.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60X water immersion objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>UPLSAPO 60XW</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>IX-71SIF-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ConOptics</td>
<td>350-160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picotrain pump Laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HighQ</td>
<td>IC-1064-10000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optical Parametric Oscillator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>APE</td>
<td>Levante IR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-102 25cm-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Half-wave plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>AHWP05M-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polarizing Beam Splitter Cubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>PBS052 or PBS053</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrometer/Monochromator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>Spectra Pro 2300i</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>PIXIS: 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Avalanche Photo Diode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>SPCM-AGR-14-12691</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYZ Piezo Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Physik Instruments</td>
<td>P 733-2CL P 721.CDQ</td>
<td>This is a combination of an XY stage and a Z objective holder</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirrors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td>
<td>These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>Z830rdc</td>
<td>To combine the different near-infrared laser beams</td>
</tr>
<tr>
<td>TCSPC board</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>Timeharp 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Symphotime Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

differential imaging of biological structures with doubly-resonant coherent anti-stokes raman scattering (cars)

Coherent Raman Imaging-Techniken haben einen dramatischen Anstieg der Aktivität in den letzten zehn Jahren durch ihr Versprechen, label-free optische Bildgebung mit hoher Spezifität molekularer 1 zu ermöglichen gesehen. Die Sensitivität dieser Techniken ist jedoch um viele Größenordnungen schwächer als Fluoreszenz, erfordern milli-molaren molekularen Konzentrationen 1,2. Hier beschreiben wir eine Technik, die die Detektion von schwachen oder niedrige Konzentrationen von Raman-aktiven Molekülen durch Verstärkung ihrer Signal mit, dass aus stark oder reich Raman Streuer gewonnen werden können. Das Zusammenspiel von kurzen gepulsten Lasern in einer biologischen Probe erzeugt eine Vielzahl von kohärenten Raman-Streuung Signale, von denen jede einzigartige chemische Informationen über die Probe zu tragen. In der Regel ist nur eines dieser Signale, zB kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS), verwendet, um ein Bild zu erzeugen, während die anderen verworfen. Wenn jedoch diese anderen Signale, einschließlich 3-Farb-CARS und Vierwellenmischung (FWM), gesammelt und im Vergleich zu den CARS-Signal, da sonst schwer zu erkennen, Informationen 3 extrahiert werden. Zum Beispiel, ist doppelt-resonanten CARS (DR-CARS) das Ergebnis der konstruktiven Interferenz zwischen zwei Resonanz-Signale 4. Wir zeigen, wie Abstimmung der drei Laser benötigt, um DR-CARS-Signale, die 2845 cm -1 CH Streckschwingung in Lipiden und den 2120 cm -1 CD-Valenzschwingung einer deuterierten Moleküle (zB deuterierte Zucker, Fettsäuren, etc.) produzieren kann genutzt werden, um sowohl Raman-Resonanzen gleichzeitig Sonde werden. Unter diesen Bedingungen zusätzlich zu den CARS-Signale von jedem Resonanz, eine kombinierte DR-CARS-Signal Sondierung beide auch generiert wird. Wir zeigen, wie Erfassung der Differenz zwischen dem DR-CARS-Signal und die Verstärkung Signal von einer reichlichen Moleküls Schwingungen kann die Empfindlichkeit für das schwächere Signal zu verstärken. Wir zeigen ferner, dass dieser Ansatz erstreckt sich sogar auf Anwendungen, bei denen sowohl Signale von verschiedenen Molekülen erzeugt werden, so dass z. B. durch die starke Raman-Signal von einem Lösungsmittel kann die schwache Raman-Signal von einer verdünnten gelöste verbessern.

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Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Eine Kombination von drei einzigen Wellenlänge kurz gepulsten Lasern wird verwendet, um kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS) und doppelt-Resonanz-CARS (DR-CARS) zu generieren. Die Differenz zwischen diesen Signalen bietet eine verbesserte Empfindlichkeit für sonst schwer kohärente Raman-Signale zu erkennen, so dass bildgebende der schwachen Raman Streuer.

Differential Imaging biologischer Strukturen mit doppelt-resonanten kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

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Serie: Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Forschung

Biologie

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Analysieren und Bauen Nukleinsäurestrukturen mit 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Umsetzung einer kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)-System auf einem Ti: Saphir und OPO-Laser-basierte Standard-Laser-Scanning-Mikroskop

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-PRESTO: Biologische Gewebe Clearing und Immunmarkierung Methoden für Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Fluoreszenz-Erholung nach Immunofluoreszenz von gelb fluoreszierende Protein Tagged p62 in Aggresome-induzierten Strukturen

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...