Nous tenons à remercier Iwan Schie et Sebastian Wachsmann-Hogiu pour leurs contributions dans le développement de la technique DR-CARS. Semaines Tyler reconnaît le soutien du Programme Scholar Laurent de Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser est reconnaissante pour le soutien de l&#39;American Heart Association à travers le programme Grant-in-Aid. Ce travail a également été soutenu en partie par un financement de la National Science Foundation. Le Centre pour la biophotonique, une science et de la NSF Technology Center, est géré par l&#39;Université de Californie, Davis, sous l&#39;accord de coopération n ° 0120999 PHY. Un soutien est également reconnu par le Centre UCD clinique Science Translational sous le numéro de subvention UL1 RR024146 du National Center for Research Resources (NCRR).

1. Génération de voitures et DR-CARS Signaux Afin de générer CARS et DR-CARS signaux simultanément, trois accordables et synchronisée courte sources laser pulsé sont nécessaires. <ol><li> Pour obtenir trois impulsions synchronisées nous commençons avec un seul laser de 10 W (PicoTrain, HighQ laser, Inc.) Ce laser a une longueur d&#39;onde fixe de 1064 nm, une longueur d&#39;impulsion fixe de 7 ps, et un taux de répétition fixe de 76 MHz. </li><li> En utilisant une série de lames demi-ondes et de polarisation du faisceau splitter cubes le faisceau est divisé en trois parties. Une lame demi-onde combiné avec un cube séparateur de faisceau polarisant permet d&#39;ajuster la quantité d&#39;énergie dans chaque composante de la poutre sans changer sa direction. Généralement, deux faisceaux sont ajustés à ~ 4,5 W chacun, et le faisceau troisième contient le solde de 1 W. </li><li> Les deux faisceaux de forte puissance sont ensuite dirigés en deux indépendantes oscillateurs paramétriques optiques (OPO est, Avante, APE GmbH, Berlin, Allemagne). OPO génération de différence de fréquence utilisez pour convertir un photon d&#39;énergie plus élevée en deux photons d&#39;énergie inférieure avec différentes longueurs d&#39;onde. En contrôlant la température du cristal utilisé pour obtenir cet effet, les longueurs d&#39;onde des photons qui en résulte peut être contrôlée à 0,1 nm. Par doublage de fréquence de ces signaux, un laser avec une longueur d&#39;onde fixe de 1064 nm peut maintenant être transformé en un faisceau laser qui peut être réglée n&#39;importe où entre 780 nm à 910 nm. En pompant deux séparés OPO avec les mêmes sources 1064 nm, on obtient deux sources lasers accordables indépendamment qui sont synchronisées automatiquement à notre laser de pompe d&#39;origine. </li><li> La troisième (la puissance la plus basse) du faisceau du laser 1064 nm pompe est dirigé vers l&#39;OPO est une combinaison de miroirs dichroïques afin que tous trois faisceaux (2 de l&#39;OPO, 1 du laser de pompe) peuvent être recombinées tard. Afin de produire efficacement des photons signal Raman cohérente des impulsions recombinés doivent se chevaucher à la fois temporellement et spatialement. Parce OPO contiennent des cavités anneau, permettant à chaque impulsion laser de passer à travers les temps multiples de cristal, les poutres envoyé par le voyage de l&#39;OPO est une distance supplémentaire qui entraîne un retard considérable par rapport au faisceau pompe d&#39;origine. Cette distance doit être compensée avec la troisième poutre en introduisant des miroirs supplémentaires que la force de cette poutre pour parcourir la même distance que les deux autres avant qu&#39;ils ne se recombinent en utilisant des miroirs dichroïques. </li><li> Afin de fournir un réglage fin de la longueur du chemin de chaque faisceau parcourt les étapes retard réglable, en utilisant rétroréflecteurs prisme, sont introduits dans chaque trajet du faisceau. </li><li> Un autre ensemble de lames demi-ondes et de polarisation du faisceau cubes splitter sont ajoutés à chaque faisceau pour nous permettre de régler la puissance de chaque faisceau de façon indépendante, sans affecter l&#39;entrée de l&#39;OPO est. </li><li> Miroirs dichroïques sont utilisés d&#39;abord combiner les faisceaux issus de deux OPO et ensuite avec le faisceau de 1064 nm. Des précautions doivent être prises pour s&#39;assurer que les poutres sont précisément chevauchent (c&#39;est à dire qu&#39;ils sont colinéaires et ont des divergences similaires). Ceci peut être vérifié en comparant le chevauchement des faisceaux à proximité (quelques centimètres) et loin de (~ 1 m) le miroir dichroïque. </li><li> L&#39;avantage d&#39;utiliser des lasers pulsés, c&#39;est que chaque impulsion peut avoir une énergie de pointe élevée à l&#39;échantillon, permettant la génération efficace de signaux cohérents Raman, tout en conservant une intensité moyenne à faible. Une intensité moyenne élevée peut endommager l&#39;échantillon. Par conséquent, afin de mieux contrôler l&#39;intensité moyenne, sans sacrifier l&#39;énergie de pointe, les trois faisceaux combinés sont envoyés à travers un modulateur électro-optique (cellule de Pockels, les ConOptics) fonctionne comme un sélecteur d&#39;impulsion, ce qui nous permet d&#39;ajuster le taux de répétition des impulsions qui arriver à notre échantillon, et donc l&#39;intensité moyenne. </li><li> Les faisceaux laser combinées sont ensuite couplés dans un microscope inversé avec un objectif de haut de NA. L&#39;objectif est généralement une lentille objectif 60 X de l&#39;eau avec une ouverture numérique (NA) de 1,2 qui a été corrigé pour l&#39;aberration chromatique sur l&#39;ensemble des accordabilité de notre OPO et le faisceau de 1064 nm. Le serrés concentrant générée par la lentille de l&#39;objectif de haute NA permet la génération la plus efficace de signaux cohérents Raman sur l&#39;échelle du micron. </li><li> Les poutres sont combinées élargie afin de déborder l&#39;arrière-port de l&#39;objectif du microscope. Par débordement à l&#39;arrière de l&#39;objectif du microscope, nous pouvons obtenir les meilleures conditions concentrer et donc la meilleure résolution spatiale dans notre système de microscope. </li><li> L&#39;objectif de notre microscope est monté sur un stade XYZ piézo qui nous permet d&#39;obtenir des images par le faisceau balaye les poutres à travers l&#39;échantillon, similaire à faisceau de balayage commerciales microscopes confocaux. </li></ol> 2. L&#39;utilisation de trois courts lasers pulsés L&#39;utilisation de trois résultats à court lasers pulsés dans la production de signaux de plusieurs voitures, à partir du c différentsombinations de deux lasers, ainsi que 3-Color CARS et DR-FWM signaux de la combinaison de ces trois lasers. <ol><li> Les longueurs d&#39;onde des signaux peut mentir spectralement proches les uns des autres. Lorsque les signaux sont rapprochés il peut être difficile de les séparer pour analyse à l&#39;aide fixée filtres passe-bande de longueur d&#39;onde et des miroirs dichroïques. Pour cette raison, nos signaux sont transmis dans un spectromètre imageur (SpectraPro 2300i, Acton Research), qui sert aussi d&#39;monochromateur efficace pour séparer spatialement les signaux de longueurs d&#39;onde différentes. </li><li> Un miroir électronique actionné retourner dans le spectromètre en position basse envoie le signal à une rétro-éclairé profonde déplétion charge-coupled device (CCD) qui fournit des informations spectroscopiques sur toute la gamme du signal entier et nous permet d&#39;identifier et d&#39;optimiser la cohérence de divers signaux Raman. </li><li> Pour sélectionner le signal avec lequel nous souhaitons nous tourner simplement l&#39;image de la grille dans le spectromètre, en utilisant le fournisseur dans le contrôle et le logiciel d&#39;acquisition de données (WinSpec, Princeton Instruments), au centre du sommet de l&#39;intérêt sur la caméra CCD et ensuite changer les position du miroir flip rediriger ce signal à un port deuxième sortie à laquelle une avalanche compter de photon unique photodiode (APD) a été attaché. </li><li> L&#39;objectif est alors raster numérisée et les signaux enregistrés sur l&#39;APD sont utilisés pour générer une image en affichant le taux de comptage de photons pour chaque pixel via le logiciel d&#39;acquisition de données (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Allemagne). </li><li> Nous répétons cette procédure d&#39;imagerie pour chaque signal désiré Raman cohérent qui nous permet de comparer les signaux pendant le post-traitement. </li></ol> 3. Préparation des échantillons Afin d&#39;obtenir des images claires et reproductibles certaines précautions doivent être prises dans la préparation de l&#39;échantillon. <ol><li> Les échantillons sont généralement préparés sur ~ 150 microns lamelles de verre épais. Ces lamelles sont suffisamment minces pour permettre l&#39;imagerie haute résolution avec les objectifs NA 1.2 qui sont habituellement utilisés. </li><li> Piégeage optique d&#39;objets diélectrique peut se produire lorsque la lumière du laser est diffractée par le biais de petits objets transparents. L&#39;utilisation de très ciblé, puissance de crête élevée, courts faisceaux laser pulsé pouvez ensuite faire glisser de petites cellules ou de bactéries le long, résultant en des images floues ou tachées. Afin d&#39;éviter cela, il peut être nécessaire pour immobiliser l&#39;échantillon sur la surface de la lamelle de verre en appliquant d&#39;abord une fine couche de poly-L-lysine par spin-coating. </li><li> Pour les cellules en culture plats en verre à fond la culture peut être utilisé pour l&#39;imagerie qui permettent, sans avoir à décoller les cellules de leurs plats de culture de cellules de croissance. </li><li> Pour la démonstration dans cette contribution nous avons d&#39;abord déposer un C. formaldéhyde fixes ver nématode elegans sur une lamelle de verre. </li><li> Puis ajoutez une goutte de 20 pl solution à 5 M de glucose deutéré au ver. La solution de glucose deutéré donne une signature de fond unique et solide Raman. </li></ol> 4. Analyse des échantillons Afin de bien profiter de l&#39;effet de l&#39;amélioration doublement résonnant les spectres Raman des deux substances Raman de résonance doit être connue. <ol><li> Une fois l&#39;échantillon est préparé sur la lamelle, il est analysé à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal Raman pour obtenir le spectre pertinentes spontanée Raman et d&#39;identifier les pics appropriés. </li><li> Pour effectuer DR-CARS nous identifions les endroits spectrale du mode d&#39;étirement CH, généralement associés à des lipides, et le mode d&#39;étirement de CD, associée avec le glucose deutéré, à 2845 cm -1 et 2121 cm -1 respectivement. </li><li> Coherent Raman est atteint lorsque la différence de fréquence entre les deux lasers correspond à la fréquence d&#39;une vibration moléculaire. En réglant une OPO à 817 nm on sondera les 2845 cm -1 en mode CH lorsqu&#39;il est combiné avec le faisceau laser 1064 nm et en réglant l&#39;OPO d&#39;autres à 868 nm, elle permettra de sonder les 2121 cm -1 pointe lorsque combiné avec un faisceau de 1064 nm . </li><li> Par le faisceau balaye l&#39;échantillon sur le microscope CARS nous pouvons maintenant observer trois signaux Raman cohérente d&#39;intérêt. Un signal de sonder les VOITURES CH étirement vibration, une CARS signal de sonder la mode d&#39;étirement de CD, et un signal DR-CARS sonder les deux. </li><li> Nous sélectionnons chaque pic comme décrit dans la section 2.3 et de prendre une image comme décrit ci-dessus. </li></ol> 5. Traitement d&#39;images Extraction des informations supplémentaires sur ces trois images exige maintenant des traitements d&#39;image assez simple. <ol><li> D&#39;abord les images doivent être normalisés. Dans la théorie de la normalisation peut être réalisé en tenant compte de l&#39;intensité de chaque laser impliquées dans chaque processus de génération de signal. En pratique, cependant cela ne fonctionne pas toujours, principalement en raison de la non-réponse spectral uniformedes miroirs dichroïques, des détecteurs, et des grilles. </li><li> Une méthode pratique pour la normalisation repose sur le fait que dans les régions où dominent les lipides purs du signal, la résonance de CD ne devrait pas contribuer à l&#39;un des signaux. De même, dans les régions de la solution de glucose pur de la résonance CH ne devrait pas contribuer à l&#39;un des signaux. Dans cet esprit, nous normalisons l&#39;image DR-CARS et l&#39;image CARS obtenue sur la résonance de CD de la solution de glucose deutéré à une région bien à l&#39;extérieur de la C. elegans qui devrait présenter aucune résonance CH. </li><li> Puis nous identifions une région dans le ver à l&#39;image de résonance CH-CARS qui est riche en lipides et la normaliser à la région correspondante dans le normalisée DR-CARS image. Pour cette méthode fonctionne correctement, nous supposons que profondément dans cette région pas de glucose deutéré est présent. Cette hypothèse est sûre puisque les lipides sont hydrophobes et ne se mélange pas avec la solution. </li><li> Maintenant, en soustrayant les normalisée CH-résonant d&#39;image voitures de la normalisation DR-CARS l&#39;image on se retrouve avec seulement le CD-amplifié de résonance du signal. </li><li> De même en soustrayant les normalisée CD-résonance image de voitures de la normalisation DR-FWM l&#39;image on se retrouve avec juste le CH-résonant signal amplifié. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Schéma du système de microscopie DR-CARS comme décrit ci-dessus. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: image en lumière blanche d&#39;un C. elegans dans une solution de glucose deutéré préparées sur une lamelle de verre et prêt pour l&#39;imagerie. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3:. Spectre Raman de l&#39;acide oléique modifiés (un acide gras insaturé) qui inclut une modification alcyne (un groupe carbone-carbone triple liaison) Les résonances CH forte à 2845 cm -1 et la résonance alcyne à 2100 cm -1 sont à la fois bien isolées de la région d&#39;empreintes digitales (la région de pics densément tassées), ce qui les rend idéales pour les marqueurs d&#39;imagerie Raman cohérente. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4:. Spectre typique des signaux Raman cohérente générée lorsque trois courts-pulsé les lasers sont engagés dans les limites de l&#39;échantillon Les flèches indiquent le processus (es) responsables de chaque signal tel que représenté par les diagrammes d&#39;énergie. Dans les schémas présentés ici flèches en pointillés indiquent les photons du laser et l&#39;OPO et du flèches pleines indiquent le signal résultant. Les lignes solides horizontales indiquent l&#39;énergie de la vibration Raman et donner une représentation visuelle qui, en RD-CARS, en mélangeant les 3 mêmes photons entrée simultanément deux différentes sondes Raman des vibrations. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5: Résultats typiques de l&#39;imagerie C. elegans ver utilisant DR-voitures et les. La rangée du haut a utilisé les trois signaux indiqués dans la figure 4 à l&#39;image d&#39;un ver dans une solution de glucose deutéré. Dans la deuxième ligne les images ont été convenablement normalisées et dans la troisième rangée de la différence des images ont été produites en soustrayant chacune des images de l&#39;image CARS DR-CARS.

<ol>
	<li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li><li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+(CARS).">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li><li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions.">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li><li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+(DR-FWM).">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li><li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting.">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li></ol>

Spectroscopie Raman et Raman à base d&#39;imagerie sont des outils puissants émergent dans les sciences bio. Actuellement, cela est particulièrement vrai pour l&#39;in vivo et in vitro d&#39;étude du métabolisme cellulaire et les troubles métaboliques dans le traitement et le stockage des lipides. La plupart des bio-macromolécules contiennent un grand nombre d&#39;analogues, principalement à base de carbone liaisons moléculaires, de sorte que les spectres Raman obtenus à partir de cellules et d&#39;organismes sont généralement une convolution des contributions des lipides, protéines, acides nucléiques, sucres, lipides etc sont relativement faciles d&#39;isoler à partir de ces spectres complexes, en raison de leur tendance à former des gouttelettes denses ou bicouches et parce qu&#39;ils contiennent des chaînes étendu avec un grand nombre de liaisons CH aliphatiques. Notre capacité d&#39;isoler des protéines spécifiques, acides aminés, ARN ou d&#39;ADN dans l&#39;environnement cellulaire complexe est, cependant, très limitée. Cela est particulièrement vrai si ces molécules d&#39;intérêt ne sont présents à des concentrations pM et ci-dessous. Ici, la capacité de la sonde faibles résonances Raman utilisant notre nouvellement introduit DR-CARS technique d&#39;imagerie différence fournit une approche potentiellement puissant pour leur microanalyse chimique et imagerie. Certes, la partie la plus compliquée de ce protocole est de l&#39;alignement et la synchronisation du système laser. Lors du démarrage à partir de zéro, la synchronisation des impulsions, c&#39;est à dire faire en sorte que les impulsions sont superposées dans le temps, malgré les différents chemins qu&#39;ils prennent peut être facilitée par l&#39;utilisation d&#39;un autocorrélateur pouls. Chevauchent fois spatiale et temporelle est atteinte, CARS et DR-CARS signaux doit être facilement détectable. Toutefois, le premier alignement est souvent brut, résultant en des signaux faibles. La meilleure pratique pour aligner ce système est d&#39;abord ainsi générer des signaux faibles et donc d&#39;améliorer la puissance du signal par un léger peaufinage les miroirs le long de chaque trajectoire et ajustant le chevauchement temporel en utilisant les étapes de retard. Bien que les actes du spectromètre / monochromateur comme une chicane très efficace pour la lumière ambiante la plus propre des résultats peut être réalisé par l&#39;exploitation du système avec les lumières de la pièce éteinte et des rideaux ou des tubes de verre pour minimiser de fond introduites par les différentes sources de lumière d&#39;autres (par exemple les écrans d&#39;ordinateur, voyants, voyants, etc.) Notre configuration particulière utilise un seul comptage de photons d&#39;avalanche photodiode (APD) et des détecteurs corrélées dans le temps de comptage de photons simples (TCSPC) du matériel de détection 5. Cela nous permet de détecter des signaux extrêmement faibles avec un bruit relativement faible, mais de nombreux groupes ont trouvé des tubes photomultiplicateurs (PMT) avec un gain variable avantageux quand effectuer des mesures similaires. L&#39;avantage de la PMT, c&#39;est qu&#39;ils offrent à gain variable et ont une surface de détection beaucoup plus grande qui peut simplifier l&#39;alignement du détecteur. De plus, notre configuration utilise les stades piézo pour traduire l&#39;objectif afin de parvenir à la numérisation du faisceau. L&#39;avantage de cela est que nous avons la capacité de revenir à n&#39;importe quel endroit dans l&#39;image précédemment numérisée avec un haut degré de précision et de prendre des mesures supplémentaires, y compris les spectres Raman spontanée. D&#39;autres groupes ont été couronnées de succès en utilisant des assemblées miroir de balayage, ou même l&#39;ensemble des unités confocale à balayage comme le système Olympus FluoView, qui propose d&#39;imagerie beaucoup plus rapide mais elle est limitée dans sa capacité à justement revenir à des positions arbitraires dans une image. Tuning les lasers pour correspondre à la résonance Raman est également une étape critique qui peut exiger une certaine optimisation. Bien que les pics Raman peut être connu dans le pic d&#39;intensité maximale spectrale obtenue à partir DR-voitures et les ne correspond pas nécessairement au maximum du pic Raman spontanée. Cela est dû à l&#39;interférence intrinsèque des signaux générés par mélange à quatre ondes conduisant à un signal de fond non-résonant et des voitures, ce qui fausse les spectres CARS rapport à spectres Raman spontanée. L&#39;emplacement spectral de la crête du signal CARS peut être calculé, mais une approche plus pratique consiste à ajuster les OPO dans plusieurs petites étapes à travers le spectre emplacement prévu de la résonance Raman. Ce processus devrait donner un maximum clair. En fait, pour la plus grande sensibilité du DR-FWM deux résonances doit être accordé à ce maximum. Un dernier problème potentiel de l&#39;approche DR-CARS doit également être discuté, c&#39;est à dire le signal DR-CARS dépendra d&#39;une distribution homogène de la molécule d&#39;actifs Raman amplifiant. Pour la plupart des objets biologiques, ce qui pourrait bien être la large résonance OH de l&#39;eau, qui est abondante et presque omniprésente. L&#39;eau est, toutefois, exclus de régions hydrophobes avec une cellule, tels que des gouttelettes lipidiques, conduisant une distorsion des signaux obtenus lors de l&#39;utilisation de la résonance de l&#39;eau pour amplifier les modes de lipides. Dans notre exemple, nous avons utilisé une solution de glucose deutéré pour générer un signal facilement détectable et abondants pour notre échantillon biologique. De même, l&#39;eau ou deutéré deutéré Buffe biologiquesrs, tels que le d-HEPES pourraient être utilisés. Dans notre exemple, le lipide gouttelettes dans le C. elegans ont été assez petit pour contenir à la fois toujours, la solution de glucose et de lipides deutérés dans le spot laser focalisé sur notre système. Ceci, cependant, n&#39;est pas généralement vrai. Un exemple particulier serait adipocytes, qui génèrent des gouttelettes lipidiques assez large au sein de leur cytoplasme. Cela signifie, toute expérience réalisée avec la technique du DR-CARS nécessite une préparation minutieuse et des expériences de contrôle pour vérifier les résultats.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60X water immersion objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>UPLSAPO 60XW</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>IX-71SIF-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ConOptics</td>
<td>350-160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picotrain pump Laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HighQ</td>
<td>IC-1064-10000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optical Parametric Oscillator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>APE</td>
<td>Levante IR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-102 25cm-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Half-wave plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>AHWP05M-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polarizing Beam Splitter Cubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>PBS052 or PBS053</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrometer/Monochromator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>Spectra Pro 2300i</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>PIXIS: 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Avalanche Photo Diode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>SPCM-AGR-14-12691</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYZ Piezo Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Physik Instruments</td>
<td>P 733-2CL P 721.CDQ</td>
<td>This is a combination of an XY stage and a Z objective holder</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirrors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td>
<td>These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>Z830rdc</td>
<td>To combine the different near-infrared laser beams</td>
</tr>
<tr>
<td>TCSPC board</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>Timeharp 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Symphotime Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

differential imaging of biological structures with doubly-resonant coherent anti-stokes raman scattering (cars)

Cohérente des techniques d&#39;imagerie Raman ont vu une augmentation spectaculaire de l&#39;activité au cours de la dernière décennie en raison de leur promesse de permettre sans étiquette d&#39;imagerie optique moléculaire élevé avec une spécificité 1. La sensibilité de ces techniques, cependant, est de plusieurs ordres de grandeur plus faible que la fluorescence, nécessitant milli-molaire 1,2 moléculaires concentrations. Ici, nous décrivons une technique qui peut permettre la détection de faibles concentrations ou faible actifs Raman des molécules en amplifiant leur signal avec celui obtenu à partir de solides ou abondants diffuseurs Raman. L&#39;interaction des lasers pulsés courts dans un échantillon biologique génère une variété de signaux cohérents de diffusion Raman, chacun de qui transportent l&#39;information chimique unique sur l&#39;échantillon. Typiquement, un seul de ces signaux, par exemple anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS), est utilisé pour générer une image tandis que les autres sont défaussées. Cependant, lorsque ces autres signaux, y compris 3-couleurs CARS et mélange à quatre ondes (FWM), sont collectés et comparés au signal CARS, autrement difficiles à détecter des informations peuvent être extraites 3. Par exemple, CARS doublement résonnant (DR-CARS) est le résultat de l&#39;interférence constructive entre les deux signaux de résonance 4. Nous démontrons comment tuning des trois lasers nécessaires pour produire DR-CARS signaux au 2845 cm -1 aux vibrations d&#39;élongation CH dans les lipides et les vibrations 2120 cm -1 CD étirement d&#39;une molécule deutérée (par exemple, les sucres deutéré, acides gras, etc) peut être utilisé pour sonder les résonances Raman simultanément. Dans ces conditions, en plus des signaux CARS de chaque résonance, un combiné DR-CARS signal de sonder à la fois est également généré. Nous démontrons comment détecter la différence entre le signal DR-CARS et amplifiant le signal de la vibration d&#39;une molécule abondante peut être utilisée pour améliorer la sensibilité des plus faibles du signal. Nous avons également démontré que cette approche s&#39;étend même à des applications où les deux signaux sont générés à partir de molécules différentes, telles que par exemple en utilisant le signal fort Raman d&#39;un solvant peut améliorer le faible signal Raman d&#39;un soluté dilué.

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Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Une combinaison de trois simples courte longueur d&#39;onde des lasers pulsés sont utilisés pour générer des anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS) et les voitures doublement résonnant (DR-CARS). La différence entre ces signaux fournit une sensibilité accrue pour les autrement difficiles à détecter des signaux cohérents Raman, permettant l&#39;imagerie de la faiblesse des diffuseurs Raman.

Imagerie différentielle des structures biologiques avec doublement résonnante anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

13.6K vues.  University of California, Davis. Une combinaison de trois simples courte longueur d'onde des lasers pulsés sont utilisés pour générer des anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS) et les voitures doublement résonnant (DR-CARS). La différence entre ces signaux fournit une sensibilité accrue pour les autrement difficiles à détecter des signaux cohérents Raman, permettant l'imagerie de la faiblesse des diffuseurs Raman.

Vidéo: Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de phase et les interférences de contraste différentiel (DIC) Microscopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

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Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthèse et d&#39;étalonnage des nanosondes phosphorescent pour l&#39;imagerie oxygène dans les systèmes biologiques

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

D&#39;analyser et de structures d&#39;acides nucléiques avec 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imagerie et de reconstruction 3D de structures vasculaires cérébraux embryonnaires poisson zèbre

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasma Membrane déformations Avec pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

La mise en œuvre d&#39;un système anti-Stokes cohérente Raman Scattering (CARS) sur un Ti: saphir et microscope à balayage laser OPO Based Laser Standard

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Récupération de fluorescence après Photoblanchiment du jaune Fluorescent Protein tag p62 en Structures induites ressemblant à Aggresome

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron spin echo, diffraction, and inelastic scattering. Unlike neutron scattering techniques that obtain information in reciprocal space, attenuation-based neutron imaging measures a signal in real space that is resolved on the order of tens of micrometers. The principle of neutron imaging follows the Beer-Lambert law and is based on the measurement of the bulk neutron attenuation through a sample. Greater attenuation is exhibited by some light elements (most notably, hydrogen), which are major components of biological samples. Contrast agents such as deuterium, gadolinium, or lithium compounds can be used to enhance contrast in a similar fashion as it is done in medical imaging, including techniques such as optical imaging, magnetic resonance imaging, X-ray, and positron emission tomography. For biological systems, neutron radiography and computed tomography have increasingly been used to investigate the complexity of the underground plant root network, its interaction with soils, and the dynamics of water flux in situ. Moreover, efforts to understand contrast details in animal samples, such as soft tissues and bones, have been explored. This manuscript focuses on the advances in neutron bioimaging such as sample preparation, instrumentation, data acquisition strategy, and data analysis using the High Flux Isotope Reactor CG-1D neutron imaging beamline. The aforementioned capabilities will be illustrated using a selection of examples in plant physiology&#160;(herbaceous plant/root/soil system)&#160;and biomedical applications&#160;(rat femur and mouse lung).

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory&#039;s High Flux Isotope Reactor

This manuscript describes a protocol for neutron radiography and computed tomography of biological samples using a High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D beamline to measure a metal implant in a rat femur, a mouse lung, and an herbaceous plant root/soil system.

Radiographie neutronique et tomodensitométrie des systèmes biologiques au réacteur isotopique à haut flux du Laboratoire national d’Oak Ridge

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron ...