يعترف واضعو الدعم المالي من قبل المؤسسات التالية : المؤسسة الوطنية للعلوم (المنحة 0719232) ، وزارة الطاقة (المنحة DEFG02 - 01ER15129) ، ومؤسسة كيك وات (041904 المنح) ، وجورج واشنطن تعزيز صندوق أبحاث الجامعة. المؤلفون ممتنون للألياف البصرية GeO2 المستندة إلى توفير أنظمة الألياف بسخاء من الأشعة تحت الحمراء (سيلفر سبرينغ ، ماريلاند) ، وكذلك لمناقشة مبدئية على بروتوكول بشأن النقش الألياف بقلم مارك E. ريفز وجوان ألف هوفمان من جورج واشنطن الجامعة. فإن الكتاب بالشكر أيضا إلى جيسيكا ألف Stolee لمساعدتها خلال تصوير بالفيديو للبروتوكول.

1. مكونات البصرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينتج عن التذرية الليزر التذرية الليزر electrospray التأين (LAESI) الطيف الكتلي (MS) بواسطة نبضة ليزر 5 نانوثانية في الطول الموجي 2.94 ميكرون. يستخدم ليزر YAG (Opolette 100 ، Opotek شركة ، كارلسباد ، كاليفورنيا) عن الاجتثاث في هذه الدراسة : A الانضباطي مذبذب بارامترية البصرية يقودها الثانية. يتم تحديد معدل تكرار ما بين 5 و 100 هرتز. هذا هو ليزر الدرجة الرابعة على أنه عند التعرض المباشر قد يسبب تلفا دائما شديد في العين أو الجلد. يمكن التفكير منتشر على شعاع الليزر أيضا أن تكون خطرة على الجلد أو العين. ارتداء حملق الليزر المناسبة للحماية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم الحصول على الألياف الضوئية المصنوعة من الزجاج ثاني أكسيد الجرمانيوم المستندة إلى الأشعة تحت الحمراء من شركة الألياف ، ونظم (سيلفر سبرينغ ، ماريلاند). إذا كان هناك Hytrel بوليميد والطلاء والألياف على اتباع الإرشادات أدناه لإخراجها من الغايات. الحرارة 1 - 2 - الميثيل pyrrolidinone إلى 130-150 درجة مئوية في غطاء الدخان. تراجع الألياف تنتهي تريد الشريط في هذا السائل لحوالي 1 دقيقة أو حتى طلاء تبدأ لتليين وتقشر. تراجع طلاء خففت الى الميثانول أو الأيزوبروبانول لمدة دقيقة ، وتمحو أي طلاء المتبقية مع منديل خالية من الوبر. بعد إزالة طلاء ، يلتصق طرفي الألياف بشفرة الياقوت (KITCO الألياف البصرية ، فيرجينيا بيتش ، فيرجينيا) بتسجيله بلطف والعض عليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق الحدة المطلوبة ، كيميائيا حفر واحدة من نهاية غيض من الألياف بنسبة 1 ٪ (V / V) حامض النيتريك (الصف كاشف) حل. تزج عموديا نهاية مختارة من الألياف في حل حامض على عمق بين 300 و 500 ميكرون بعد الاتصال الأولي. بعد حوالي 15 دقيقة من النقش ، وغيض فصل عفويا من سطح الحمض. هذه النتائج في تلميح الألياف شحذ مع ~ دائرة نصف قطرها 15 ميكرون للانحناء. شطف مع الماء منزوع الأيونات لإزالة أي بقايا الحمض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل نهاية محفورا من الألياف على micromanipulator (MN - 151 ، Narishige ، طوكيو ، اليابان) ، وإحضاره إلى مقربة (~ 20 ميكرون) من سطح الخلية لترسب كفاءة في استخدام الطاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد نهاية غير محفورا من الألياف الضوئية من قبل تشوك الألياف العارية (BFC300 ، Siskiyou المؤسسة والمنح باس ، OR). لمحاذاة البصرية ، هي التي شنت على الألياف تشوك المترجم خمسة المحور (BFT - 5 ، Siskiyou المؤسسة والمنح باس ، OR). ويقترن طاقة الليزر (0،5-1 ميغا جول) في الألياف من خلال التركيز على شعاع من فلوريد الكالسيوم ، بلانو عدسة محدبة أو antireflection ZnSe المغلفة (المنتجات البصرية بالأشعة تحت الحمراء ، فارمنجديل ، نيويورك) إلى نهاية غير محفورا فيها. تستخدم المرايا الذهب المحمية (PF10 - 03 - M01 ، Thorlabs ، نيوتن ، نيوجيرسي) لتوجيه شعاع ليزر تحت الحمراء منتصف العدسة على التركيز. </li></ol> 2. Electrospray الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن بناء نظام electrospray باستخدام المكونات التالية : الاتحاد مع المعادن الطويق perfluoroelastomer الموصلة ، والتجهيزات ، كم أنابيب وإبر الميناء (على سبيل المثال ، U - 435 ، M215 ، F - 331Nx ، F - 242x ، 9013 ، على التوالي آيدكس الصحة والعلوم ، البلوط هاربور ، واشنطن) ، وكذلك أنابيب تنصهر السيليكا (على سبيل المثال ، CT360 - 100 - 50 - 5 ، الهدف الجديد ، وشركة مدينة وبرن ، ماجستير). يرصد باعث الموصى بها من الفولاذ المقاوم للصدأ ، ولها طرف مدبب مع معرف 50 ميكرومتر (على سبيل المثال ، MT320 - 50 - 5 - 5 ، الهدف الجديد ، وشركة مدينة وبرن ، ماجستير). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجهيز 50 ٪ من محلول الميثانول مع حمض الخليك 0.1 ٪ (V / V) لelectrospray. ويتم ضخ الحل بمعدل من 200 إلى 300 دقيقة / NL بواسطة مضخة محقنة (جهاز هارفارد ، Holliston ، MA) به ، مثلا ، 500 حقنة ميكرولتر (81222 شركة هاملتون ، رينو ، NV) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الجهد العالي بين 2800 3000 والخامس للاتحاد المعدنية بنسبة إمدادات الطاقة للوائح (PS350 ، ستانفورد للأبحاث سيستمز ، سانيفيل كاليفورنيا) لإنشاء electrospray مطرد. تأكد من أن جميع التوصيلات الكهربائية آمنة ومحمية بشكل صحيح مع أسس التدريع. يمكن الاتصال مباشرة مع الجهد العالي يتعرض نتيجة لصدمة كهربائية. </li></ol> 3. نموذج التعامل مع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينة الأنسجة الحية أو خلية من مصدر المناسبة والاحتفاظ بها على النحو الموصى به من قبل التحليل. تم شراء المصابيح الآليوم CEPA لهذه التظاهرة من أحد المتاجر المحلية. قطع بصلة طوليا بواسطة مشرط الجراحة. وكان جزء قليل من السنتيمتر مقياس مقطوع في قطاع غزة. غير مقشر لأحادي الطبقة سليمة من أنسجة البشرة الداخلية قبالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم السطح الرطب للبشرة لتركيب الأنسجة على شريحة المجهر والزجاج قبل تنظيفها. عقد الشريحة من قبل صاحب الهدف العام لوحة (FP01 ، Thorlabs شركة ، نيوتن ، نيوجيرسي) التي شنت على مرحلة الترجمة من ثلاثة محاور لتحديد المواقع. الحصول على أطياف الشامل مباشرة بعد تركيب العينة لمنع تدهور الخلايا. </li></ol> 4. التصور النظام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم المجاهر اثنين لمسافات طويلة لتحديد الخلايا لتحليل والحفاظ على المسافة بين طرف شحذ الألياف وسطح الخلية. هي التي شنت هذه الأخيرة تحت زاوية 15 درجة -30 ° تقاس من السطح. هذا النظام يتكون من مجلةتصحيح اونج المجهر الفيديو عن بعد (7X دقة التكبير البصري ، ادموند البصريات ، بارينغتون ، ونيو جيرسي) مع اللانهاية 5X عدسة الهدف (M آبو خطة 5X ، شركة شركة ميتيو تويو ، كاناغاوا ، اليابان) مزودة كاميرا CCD (مارلن F131 ، الحلفاء الرؤية تكنولوجيز ، Stadtroda ، ألمانيا) لرصد والتقاط الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي التي شنت المجهر الفيديو الثاني في الزاوية اليمنى لسطح العينة لتصور خلايا من أعلى. هذا النظام يوفر التغذية الراجعة المرئية لمحاذاة الحافة الألياف على الخلية المحددة في اقتلاع والتحليل. وهو يتألف من دقة التكبير البصري 7X (ادموند البصريات ، بارينغتون ، نيوجيرسي) ، مزودة اللانهاية 10X تصحيح الهدف طويل المسافة عمل العدسة (M خطة آبو 10X ، شركة شركة ميتيو تويو ، كاناغاوا ، اليابان) وكاميرا CCD. </li></ol> 5. اقتناء الأطياف الشامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الليزر ، electrospray ومطياف الكتلة ، على سبيل المثال ، وهو رباعي نظام وقت من الرحلة (Q - TOF رئيس مجلس الوزراء ووترز ، ميلفورد ، MA). تحسين هندسة مصدر ايون LAESI عن طريق ضبط الموقف من بقعة التذرية ، وباعث electrospray بالنسبة لبعضها البعض ، وفتحة لمطياف الكتلة لتحقيق أقصى كثافة الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خلية من الاهتمام للتحليل باستخدام نظام التصور أعلى عرض. بعد الاختيار ، وتحرك في المرحلة عينة لجعل الخلية المحددة مباشرة تحت الحافة شحذ من الألياف البصرية. باستخدام المجهر جنبا عرض تعدل تلميح إلى سطح الخلية المسافة إلى 20 ميكرون ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبضات الليزر النار على الخلية المحددة خلال قمة الألياف محفورا. هذه النتيجة في ثقب في جدار الزنزانة ، وطرد من السيتوبلازم في شكل جسيمات. وتسجل بعد من قبل postionization electrospray ، يتم جمع الأيونات التي تنتجها مطياف الكتلة والأطياف الشامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على البيانات ، ووضع ليزر ، electrospray ومطياف الكتلة في وضع الاستعداد أو إيقاف تشغيلها. إبقاء ألف ablated CEPA عينات الأنسجة لمراقبة الاختياري المجهر الضوئي. </li></ol> 6. ممثل النتائج نجاح الاجتثاث من النتائج خلية واحدة في انفجار جدار الخلية وجمع طائفة LAESI الشامل. تجربة ناجحة النتائج عادة في أي الاجتثاث و / أو أي الطيف الشامل. لأغراض العرض التوضيحي ، ونحن تقديم النتائج من تحليل LAESI - MS من خلية واحدة البشرة جزءا لا يتجزأ من ألف CEPA مبة. ويبين الشكل 2A ممثل صورة المجهر الضوئي بعد أخذ عينات من خلية. جدار الخلية غير مثقوبة ، ويقتصر مدى ثقب من الحدود مع الخلايا المجاورة. الخلايا المجاورة تبدو سليمة. ويبين الشكل 2B كتلة LAESI ممثل الطيف المنتجة من الخلية. تم الكشف عن مجموعة واسعة من الأيونات من ألف CEPA الخلية واستنادا كتلها دقيقة ، وأنماط توزيع النظائر ، وذلك ، في بعض الحالات ، جنبا إلى جنب أطياف الشامل ، ويتم تعيين مؤقت لانهم الأيضات الذاتية. وكان الكشف عن الأيونات من خلية واحدة مماثلة لتلك التي لوحظت في تحليل الأنسجة نفسها التقليدية LAESI - MS من عدة خلايا. 13 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. التخطيطي التحليل خلية واحدة بواسطة LAESI - MS. ويقترن نبضة ليزر تحت الحمراء منتصف إلى الألياف الضوئية وتسليمها الى وضع العينة على الشريحة الزجاجية. غيض من الألياف شحذ يركز الضوء في الخلية المستهدفة والطاقة المودعة رشقات نارية الخلية. يتم دمج عمود الاجتثاث المنتجة (النقط الحمراء) مع عمود electrospray (النقاط السوداء) وتتجمع قطرات (نقطة خضراء) مما أدى إلى إنتاج أيون عينة محددة. ويتم تحليل هذه الأيونات والكشف عنها بواسطة مطياف الكتلة (MS). وتستخدم اثنين من المجاهر الفيديو لمسافات طويلة ، مجهر مجهر 1 و 2 ، لرصد المسافة بين طرف والألياف على سطح الخلية وتحديد خلية للتحليل ، على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2a.jpg" alt="الشكل 2A" /> الشكل 2A. تذرية علامة على خلية واحدة من البشرة A. CEPA مبة. الخلايا المجاورة لا يحمل الضرر وضوحا وبالتالي يمكن تحليلها بشكل منفصل. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2b.jpg" alt="الرقم 2B" /> الرقم 2B الطيف الشامل. المقابلة لالاجتثاث من ألف واحد CEPA البشرة الخلية يظهر وجود مستقلبات الابتدائية والثانوية.

<ol>
	<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Mass+Spectrometry.">Ambient Mass Spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li><li>Chen, Z. Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+plume+expansion+in+atmospheric+pressure+midinfrared+laser+ablation+of+water-rich+targets.">Early plume expansion in atmospheric pressure midinfrared laser ablation of water-rich targets.</a> Physical Review E. E77, 036316-036316 (2008).</li><li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Molecular+Imaging+by+Infrared+MALDI.">Atmospheric Pressure Molecular Imaging by Infrared MALDI.</a> Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 523-532 (2006).</li><li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Infrared+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+for+Plant+Metabolomics.">Atmospheric Pressure Infrared MALDI Imaging Mass Spectrometry for Plant Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 407-420 (2007).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+for+Atmospheric+Pressure+in+Vivo,+and+Imaging+Mass+Spectrometry.">Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Shrestha, B., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+pharmaceuticals+and+excreted+xenobiotic+and+endogenous+metabolites+with+atmospheric+pressure+infrared+MALDI+mass+spectrometry.">Rapid analysis of pharmaceuticals and excreted xenobiotic and endogenous metabolites with atmospheric pressure infrared MALDI mass spectrometry.</a> Metabolomics. 4, 297-311 (2008).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Molecular+Imaging+and+Depth+Profiling+of+Live+Tissue+by+Infrared+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Ambient Molecular Imaging and Depth Profiling of Live Tissue by Infrared Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric+Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82, 982-988 (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. , (2010).</li><li>Sripadi, P., Nazarian, J., Hathout, Y., Hoffman, E., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+metabolites+from+the+untreated+tissue+of+Torpedo+californica+electric+organ+by+mid-infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 5, 263-276 (2009).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Metabolic+Profiling+of+Single+Cells+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">In Situ Metabolic Profiling of Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+and+Analysis+of+a+Single+Cell+by+Consecutive+Laser+Pulses.">Ablation and Analysis of a Single Cell by Consecutive Laser Pulses.</a> Applied Physics A. , (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

محتوى الماء من السيتوبلازم الخلية والشد من جدار أو غشاء الخلية هي العوامل الحاسمة التي تنظم الاجتثاث من الخلايا واحدة خلال LAESI - MS التحليل. وفلوينس الليزر لابد من تعديلها لتصل إلى عتبات الاجتثاث من أنواع مختلفة من الخلايا. والقى فلوينس الليزر يعتمد على الطاقة من نبضة ليزر ، وعلى المسافة بين طرف والألياف على سطح الخلية. التقليل من اضطراب الخلايا المجاورة خلال التحليل خلية واحدة أمر بالغ الأهمية. الحفاظ على طاقة الليزر على عتبة الاجتثاث يحد من تأثير التحليل على الخلايا المجاورة. واحد من التطبيقات الممكنة والتي تستخدم خلايا واحد كما بكسل الحجمي الطبيعية (voxels) للتصوير الكيميائية MS. مقارنة لجمع البيانات على الشبكة الاصطناعية غالبا مستطيل والكيميائية التصوير من خلية واحدة الأنسجة في وقت من المرجح أن يحتفظ التنظيم المكاني للالتفاعلات الكيميائية الحيوية بين الخلايا.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>45727</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>65548</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-methyl-2-pyrrolidinon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>M79603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>39259</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct analysis of single cells by mass spectrometry at atmospheric pressure

تحليل المواد الكيميائية الحيوية في الخلايا واحد مهم لفهم استقلاب الخلية ، ودورة الخلية ، والتكيف ، والحالات المرضية ، وما إلى ذلك وحتى أنواع الخلايا نفسها معرضا للماكياج والبيوكيميائية غير متجانسة تبعا لظروفها الفسيولوجية ، والتفاعل مع البيئة. الأساليب التقليدية لقياس الطيف الكتلي (MS) المستخدمة لتحليل الجزيئات الحيوية في الخلايا واحدة تعتمد على تحضير عينة واسعة النطاق. ويمكن إزالة الخلايا من بيئتها الطبيعية ، وتجهيز العينات واسعة النطاق تؤدي إلى تغييرات في تركيبة الخلوية. أساليب التأين المحيطة تمكين تحليل العينات في بيئتهم الأصلية ، ودون تحضير عينة واسعة النطاق. 1 والتقنيات التي تعتمد على الأشعة تحت الحمراء في منتصف التذرية الليزر (منتصف IR) من المواد البيولوجية في الطول الموجي 2.94 ميكرون الاستفادة من الإثارة المفاجئة من المياه التي تنتج في المرحلة وقد أظهرت الانفجار. التأين 2 تقنيات البيئة المحيطة استنادا أشعة الليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء ، مثل الليزر التذرية electrospray التأين (LAESI) والضغط الجوي مصفوفة الأشعة تحت الحمراء بمساعدة الليزر المج التأين (ا ف ب IR - MALDI) ، بنجاح القدرة على تحليل المياه مباشرة والأنسجة الغنية biofluids في الضغط الجوي. 3-11 وفي LAESI الاجتثاث ليزر تحت الحمراء منتصف عمود التي تتكون في معظمها من الجسيمات المحايدة من coalesces عينة مع قطرات electrospray مشحونة لإنتاج الأيونات. مؤخرا ، أجريت منتصف IR الاجتثاث من الخلايا واحد عن طريق تقديم الإشعاع منتصف الأشعة تحت الحمراء عن طريق الألياف محفورا. وكان postionized السحابة الناتجة من هذا الاجتثاث من قبل electrospray تمكين تحليل الأيضات متنوعة في الخلايا واحد عن طريق LAESI - MS (12). توضح هذه المقالة بروتوكول تحليل مفصل للخلية واحدة باستخدام LAESI - MS. عرض شريط الفيديو يظهر تحليل خلية واحدة البشرة من الجلد لمبة CEPA الآليوم. يظهر النظام التخطيطي في الشكل 1. وقدم ممثل المثال الاجتثاث خلية واحدة وطائفة والشامل LAESI من الخلية في الشكل 2.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure at JoVE.com

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

يتم تنفيذ واحد من قبل خلية التحليل الطيفي على الخلايا النباتية والحيوانية في الضغط الجوي باستخدام الألياف الضوئية لشحذ عينة الخلايا للالتذرية الليزر electrospray التأين (LAESI) مطياف الكتلة.

التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

direct-analysis-single-cells-mass-spectrometry-at-atmospheric

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K Views.  George Washington University. يتم تنفيذ واحد من قبل خلية التحليل الطيفي على الخلايا النباتية والحيوانية في الضغط الجوي باستخدام الألياف الضوئية لشحذ عينة الخلايا للالتذرية الليزر electrospray التأين (LAESI) مطياف الكتلة.

Video: Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

تي موجة ايون التنقل الكتلة الطيفي : الإجراءات التجريبية الأساسية لتحليل البروتين مجمع

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

الضغط الجوي التصوير الجزيئي من الأنسجة البيولوجية والأغشية الحيوية التي LAESI طيف الكتلة

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

أميد الهيدروجينية / الديتريوم الطيف الكتلي تبادل و- TOF MALDI تحليل Pak2 التنشيط

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

تحليل الخط-1 Retrotransposition في واحدة نواة مستوى

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

تطبيقات أحادية التحقيق: وسائل التصوير الطيفي والتحليل خلية واحدة في ظل الظروف المحيطة

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

إعداد نموذج للإعلام-قياس الطيف الكتلي المستندة البروتيوميات تحليل ميكروفيسيلس العين

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...