המחברים מודים תמיכה כספית על ידי המוסדות הבאים: הקרן הלאומית למדע (מענק 0,719,232), מחלקת האנרגיה (גרנט DEFG02-01ER15129), קק WM Foundation (גרנט 041,904), ואת מאוניברסיטת ג&#39;ורג&#39; וושינגטון קרן מחקר שיפור. המחברים מודים עבור GeO2 מבוססי סיבים אופטיים שסופקו בנדיבות לדיון הראשוני על פרוטוקול בדבר תחריט סיבים ידי Mark E. ריבס ג&#39;ואן א הופמן של ג&#39;ורג&#39; וושינגטון על ידי מערכות סיבים אינפרא אדום (Silver Spring, MD), כמו גם האוניברסיטה. המחברים רוצה גם להודות ג&#39;סיקה א Stolee על עזרתה במהלך במצלמת וידיאו את הפרוטוקול.

1. רכיבים אופטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבלציה לייזר עבור יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ספקטרומטריית מסה (MS) מופק על ידי 5 ns הדופק לייזר באורך גל 2.94 מיקרומטר. מתנד אופטי מתכונן פרמטרית מונע על ידי Nd: YAG לייזר (Opolette 100, Opotek Inc, בקרלסבד, קליפורניה) משמש אבלציה במחקר זה. שיעור החזרה נבחר בין 5 ל 100 הרץ. זהו לייזר בכיתה ד &#39;כי בחשיפה ישירה עלולה לגרום לנזק בלתי הפיך חמור בעין או העור. השתקפות מפוזר של קרן לייזר יכולה להיות גם מסוכנת העור או העיניים. לבשי goggle לייזר מתאים להגנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיב אופטי עשוי זכוכית דו מבוססי גרמניום התקבל אינפרא מערכות סיבים, Inc (Silver Spring, MD). אם יש Hytrel ו polyimide ציפויים על הסיב בצע את ההוראות שלהלן כדי להסיר אותם מן הקצוות. מחממים 1-methyl-2-pyrrolidinone ל 130-150 מעלות צלזיוס במנדף קטר. טובלים את קצות הסיבים אתה רוצה להתפשט לתוך הנוזל הזה דקות או עד כ 1 ציפוי מתחיל להתרכך להתקלף. טובלים את ציפוי מרוככת לתוך מתאנול או isopropanol לרגע, ולנגב את כל ציפוי הנותרים עם מפית ונטולת מוך. לאחר הסרת ציפוי, לדבוק בשני הקצוות של סיבים עם להב ספיר (KITCO סיבים אופטיים, וירג&#39;יניה ביץ&#39;, VA) כשקלע בעדינות מצלם אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג את חדות הרצוי כימית סוף לחרוט אחד קצה סיב ב -1% (v / v) חומצה חנקתית (כיתה מגיב) פתרון. אנכית לטבול את קצה נבחרים של סיבים לתוך התמיסה חומצה עד לעומק של 300-500 מיקרומטר לאחר המגע הראשוני. לאחר כ 15 דקות של תחריט, הטיפ יהיה ספונטני להתנתק מפני השטח חומצה. התוצאה היא קצה סיב חידד עם רדיוס 15 ~ מיקרומטר של עקמומיות. לשטוף עם מים deionized כדי להסיר שאריות חומצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר סוף חרוט של סיבים על micromanipulator (MN-151, Narishige, טוקיו, יפן) ולהביא אותו אל קרבה (~ 20 מיקרומטר) של תא השטח להפקדה לחיסכון באנרגיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את קצה שאינם חרוט של סיב אופטי באמצעות סיב צ&#39;אק חשוף (BFC300, Siskiyou Corporation, Pass מענקים, OR). במשך יישור אופטי, צ&#39;אק הסיבים הוא רכוב על המתרגם חמש ציר (BFT-5, Siskiyou Corporation, Pass מענקים, OR). אנרגיית הלייזר (0.5-1 mJ) הוא בשילוב לתוך סיב על ידי מיקוד אלומת ידי פלואוריד Plano-קמור סידן או ZnSe מצופה antireflection העדשה (מוצרים אופטיים אינפרא אדום, Farmingdale, ניו יורק) על סופו הלא חרוט. מראות זהב מוגן (PF10-03-M01, Thorlabs, ניוטון, NJ) משמשים כדי לכוון את אלומת האור אמצע IR לייזר על גבי העדשה מתמקדת. </li></ol> 2. Electrospray ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערכת electrospray ניתן לבנות באמצעות הרכיבים הבאים: איגוד מתכת עם טבעת חזוק perfluoroelastomer, אביזרי מוליך, שרוול צינור, מחט הנמל (למשל, U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, בהתאמה IDEX בריאות למדעים, Oak Harbor, WA), כמו גם צינורות סיליקה התמזגו (למשל, CT360-100-50-5, ניו המטרה Inc, Woburn, MA). פולט המליצה עשוי נירוסטה בעל קצה קוני עם מזהה 50 מיקרומטר (למשל, MT320-50-5-5, ניו המטרה Inc, Woburn, MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מתנול 50% עם חומצה אצטית 0.1% (v / v) עבור electrospray. הפתרון נשאבים בקצב של מינימום 200-300 / nl ידי משאבת מזרק (הרווארד Apparatus, Holliston, MA) באמצעות, למשל, מזרק 500 μl (81,222, חברת המילטון, רינו, NV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מתח גבוה בין 2800 ו - 3000 V לאיגוד מתכת על ידי אספקת חשמל מוסדר (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) כדי ליצור electrospray יציב. ודא שכל חיבורי החשמל הם בטוחים מוגן עם סיכוך מוארקים כיאות. מגע ישיר עם מתח גבוה חשופה עלולה לגרום להתחשמלות. </li></ol> 3. לדוגמה טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את רקמת חיים או דגימת תאים ממקור המתאים ולשמור אותם מומלץ כמו לפני ניתוח. נורות Allium cepa להפגנה זו נרכשו בחנות המקומית. גזור נורה longitudinally ידי אזמל מנתחים. קטע סנטימטר כמה בקנה מידה נותח לרצועה. Monolayer שלם של רקמת אפידרמיס הפנימי הוא קילף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשטח הרטוב של האפידרמיס משמש הר רקמה על שקופית מראש לנקות מיקרוסקופ זכוכית. החזק את השקופית על ידי בעל לוחית בכלל מטרה (FP01, Thorlabs בע&quot;מ, ניוטון, NJ) רכוב על הבמה שלוש ציר תרגום מיצוב. רוכשת את הספקטרום המונית מיד לאחר ההרכבה את המדגם כדי למנוע השפלה התא. </li></ol> 4. ויזואליזציה מערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני מיקרוסקופים למרחקים ארוכים משמשות כדי לבחור את התאים לניתוח כדי לשמור על המרחק בין קצה סיב חידד את שטח פני התא. האחרון הוא רכוב תחת זווית ° 15 ° -30 נמדד מפני השטח. מערכת זו מורכבת אלוידאו אונג מרחק מיקרוסקופ (זום אופטי 7x דיוק, אדמונד אופטיקה, ברינגטון, NJ) עם אינסוף 5x לתקן עדשה אובייקטיבי (Apo M תוכנית 5x, Mitutoyo ושות&#39;, קאנאגאווה, יפן) מצויד במצלמת CCD (מרלין F131, בעלות הברית ויז&#39;ן טכנולוגיות , Stadtroda, גרמניה) לניטור לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיקרוסקופ וידאו השני הוא רכוב בזווית ישרה אל פני השטח מדגם לדמיין את התאים מלמעלה. מערכת זו מספקת משוב חזותי כדי ליישר את קצה סיב על התא הנבחר עבור אבלציה וניתוח. זה מורכב דיוק זום אופטי 7x (אדמונד אופטיקה, ברינגטון, NJ), מצויד באינסוף 10x תיקן עבודה ארוכות אובייקטיבי מרחק העדשה (M תוכנית Apo 10x, Mitutoyo ושות&#39;, קאנאגאווה, יפן) מצלמה CCD. </li></ol> 5. רכישת ספקטרה המוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הלייזר, את electrospray ואת ספקטרומטר מסה, למשל, מערכת quadrupole הזמן של הטיסה (Q-TOF פרמייר, ווטרס, Milford, MA). מטב את הגיאומטריה של המקור יון LAESI ידי התאמת המיקום של המקום אבלציה ו פולט electrospray ביחס אחד לשני ואת פתח של ספקטרומטר מסה להשיג בעוצמות יון מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התא עניין לניתוח באמצעות מערכת העליונה להציג ראיה. לאחר הבחירה, להזיז את הבמה מדגם להביא את התא הנבחר ישירות מתחת קצה מחודד של סיב אופטי. באמצעות מיקרוסקופ צד להציג להתקין מחדש את קצה אל תא השטח המרחק ~ 20 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אש פעימות לייזר בתא הנבחר דרך קצה סיב חרוט. זו התוצאה ניקוב של קיר התא לבין פליטה של ​​בציטופלסמה בצורה של חומר חלקיקי. לאחר postionization ידי electrospray, היונים המיוצרים נאספים על ידי ספקטרומטר מסה ספקטרה מסה נרשמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רכישת נתונים, לשים את לייזר, electrospray ואת ספקטרומטר מסה במצב המתנה או לכבות אותם. שמור את א ablated cepa דגימה להסתכלות אופציונלי על ידי מיקרוסקופ אור. </li></ol> 6. נציג תוצאות אבלציה מוצלחת של התוצאות תא בודד בתוך התפוצצות של התא הקיר ואת האוסף של הספקטרום מסה LAESI. ניסוי מוצלח בדרך כלל התוצאות לא אבלציה ו / או לא ספקטרום המונית. למטרות הדגמה, אנו מציגים את התוצאות מניתוח LAESI-MS של תא בודד אפידרמיס מוטבע א cepa הנורה. ציור 2a מראה תמונה נציג מיקרוסקופיה אופטית לאחר דגימה של תא. דופן התא הוא מחורר והיקף ניקוב הוא מוגבל על ידי גבולות עם תאים שכנים. תאים סמוכים נראה שלם. איור 2b מראה ספקטרום המונית נציג LAESI המופק התא. מגוון רחב של יונים מזוהים מ - א &#39; cepa סלולריים המבוססים על מסות מדויק שלהם, דפוסי איזוטופ הפצה, במקרים מסוימים, ספקטרה טנדם המונית, הם מוקצים בהיסוס אל מטבוליטים אנדוגני. יונים מזוהה מתא בודד היו דומים לאלה שנצפו בניתוח של רקמות זהה על ידי קונבנציונאלי LAESI-MS של תאים רבים. 13 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ניתוח סכמטי של תא בודד על ידי LAESI-MS. הדופק אמצע IR לייזר בשילוב לתוך סיב אופטי ונמסרו המדגם להציב בשקופית זכוכית. קצה סיב חידד מתמקד האור לתוך התא היעד ואת האנרגיה שהופקדו התפרצויות התא. פלומת אבלציה המיוצר (נקודות אדומות) היא התמזגה עם פלומת electrospray (נקודות שחורות) הטיפות להתגבש (נקודות ירוקות) וכתוצאה מכך ייצור יון ספציפי המדגם. יונים אלה הם נותחו זוהה על ידי ספקטרומטר מסה (MS). שני ארוכות וידאו מרחק מיקרוסקופים, מיקרוסקופ מיקרוסקופ 1 ו 2, מנוצלים כדי לפקח על המרחק בין קצה סיבים על פני התא כדי לבחור תא לניתוח, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2a.jpg" alt="איור 2a" /> איור 2 א. אבלציה סימן על תא אפידרמיס בודד של א &#39; cepa הנורה. תאים סמוכים אינם מציגים נזק לעין, ולאחר מכן ניתן לנתח בנפרד. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2b.jpg" alt="איור 2b" /> איור 2b. המוניים המתאימים אבלציה של א &#39;אחד ספקטרום תא אפידרמיס cepa מראה נוכחות של מטבוליטים ראשוניים ומשניים.

<ol>
	<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Mass+Spectrometry.">Ambient Mass Spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li><li>Chen, Z. Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+plume+expansion+in+atmospheric+pressure+midinfrared+laser+ablation+of+water-rich+targets.">Early plume expansion in atmospheric pressure midinfrared laser ablation of water-rich targets.</a> Physical Review E. E77, 036316-036316 (2008).</li><li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Molecular+Imaging+by+Infrared+MALDI.">Atmospheric Pressure Molecular Imaging by Infrared MALDI.</a> Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 523-532 (2006).</li><li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Infrared+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+for+Plant+Metabolomics.">Atmospheric Pressure Infrared MALDI Imaging Mass Spectrometry for Plant Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 407-420 (2007).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+for+Atmospheric+Pressure+in+Vivo,+and+Imaging+Mass+Spectrometry.">Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Shrestha, B., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+pharmaceuticals+and+excreted+xenobiotic+and+endogenous+metabolites+with+atmospheric+pressure+infrared+MALDI+mass+spectrometry.">Rapid analysis of pharmaceuticals and excreted xenobiotic and endogenous metabolites with atmospheric pressure infrared MALDI mass spectrometry.</a> Metabolomics. 4, 297-311 (2008).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Molecular+Imaging+and+Depth+Profiling+of+Live+Tissue+by+Infrared+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Ambient Molecular Imaging and Depth Profiling of Live Tissue by Infrared Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric+Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82, 982-988 (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. , (2010).</li><li>Sripadi, P., Nazarian, J., Hathout, Y., Hoffman, E., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+metabolites+from+the+untreated+tissue+of+Torpedo+californica+electric+organ+by+mid-infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 5, 263-276 (2009).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Metabolic+Profiling+of+Single+Cells+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">In Situ Metabolic Profiling of Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+and+Analysis+of+a+Single+Cell+by+Consecutive+Laser+Pulses.">Ablation and Analysis of a Single Cell by Consecutive Laser Pulses.</a> Applied Physics A. , (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תכולת המים של הציטופלסמה של התא ואת חוזק מתיחה של קיר התא או הממברנה הם גורמים קריטיים הקובעים את אבלציה של תאים בודדים במהלך ניתוח LAESI-MS. השטף הלייזר חייב להיות מותאם כדי להגיע אל סף אבלציה של סוגי תאים שונים. השטף לייזר נמסר תלוי באנרגיה של הדופק לייזר על המרחק בין קצה סיבים על פני התא. צמצום ההפרעות של תאים שכנים במהלך הניתוח תא בודד הוא קריטי. שמירה על אנרגיית הלייזר על סף אבלציה מגביל את ההשפעה של הניתוח על תאים סמוכים. אחד היישומים האפשריים הוא באמצעות תאים בודדים כמו פיקסלים נפח טבעי (voxels) עבור דימות כימי על ידי MS. לעומת איסוף נתונים על רשת מלבני לעתים קרובות מלאכותי, דימות כימי של תא רקמת אחד בכל פעם, סביר יותר כדי לשמר את הארגון המרחבי של יחסי הגומלין הביוכימיים בין תאים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>45727</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>65548</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-methyl-2-pyrrolidinon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>M79603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>39259</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct analysis of single cells by mass spectrometry at atmospheric pressure

ניתוח ביוכימיים בתאים אחד חשוב להבנת מטבוליזם התא, מחזור התא, הסתגלות, מצבי מחלה, וכו &#39;גם סוגי תאים באותה תערוכה איפור ביוכימיים הטרוגניות בהתאם לתנאי פיזיולוגיים שלהם ואת האינטראקציות עם הסביבה. בשיטות המקובלות של ספקטרומטריית מסה (MS) המשמשים לניתוח של ביומולקולות בתא בודד להסתמך על הכנה מדגם נרחב. הסרת תאים בסביבתם הטבעית ועיבוד מדגם נרחב יכול להוביל שינויים בהרכב הסלולר. שיטות יינון אמביינט לאפשר ניתוח של דגימות בסביבה המקורית שלהם, ללא הכנה מדגם נרחב. 1 הטכניקות המבוסס על אבלציה אמצע לייזר אינפרא אדום (אמצע IR) של חומרים ביולוגיים באורך גל 2.94 מיקרומטר לנצל את עירור פתאומית של מים כי תוצאות שלב הפיצוץ. 2 שיטות יינון אמביינט מבוסס על קרינה אמצע IR לייזר, כגון יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ובלחץ אטמוספרי אינפרא אדום מטריצה ​​בעזרת לייזר יינון desorption (AP IR-MALDI), הוכיחו בהצלחה את היכולת לנתח ישירות מים רקמות עשירות biofluids בלחץ אטמוספרי. 3-11 ב LAESI אמצע IR אבלציה לייזר פלומת כי בעיקר מורכב של חומר חלקיקי ניטרלי מן המדגם מתמזגת עם טיפות electrospray טעון לייצר יונים. לאחרונה, אמצע IR אבלציה של תאים בודדים בוצעה על ידי מתן קרינה אמצע IR באמצעות סיב חרוט. פלומת שנוצר אבלציה זה היה postionized ידי electrospray המאפשר ניתוח של מטבוליטים שונים בתאי יחיד על ידי LAESI-MS. 12 מאמר זה מתאר את פרוטוקול מפורט לניתוח תא בודד באמצעות LAESI-MS. הסרטון הציג מדגים את הניתוח של תא אפידרמיס בודד מן העור של הנורה Allium cepa. סכמטי של המערכת מוצג באיור 1. למשל נציג אבלציה תא יחיד קשת מסה LAESI מהתא ניתנים באיור 2.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure at JoVE.com

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

ניתוח תא יחיד מבוצע על ידי ספקטרומטריית מסה בתאי צמחים ובעלי חיים בלחץ אטמוספרי באמצעות סיב אופטי מחודד המדגם תאים יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ספקטרומטריית מסה.

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

direct-analysis-single-cells-mass-spectrometry-at-atmospheric

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K Views.  George Washington University. ניתוח תא יחיד מבוצע על ידי ספקטרומטריית מסה בתאי צמחים ובעלי חיים בלחץ אטמוספרי באמצעות סיב אופטי מחודד המדגם תאים יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ספקטרומטריית מסה.

Video: Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

אמיד מימן / דאוטריום Exchange &amp; MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

הכנת הדוגמא מסה ספקטרומטר מבוססת על ניתוח פרוטאומיקס של עינית Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...