ملاحظة : للحفاظ على ثقافة ظروف معقمة ، وتتم كافة الإجراءات في هذا البروتوكول على استخدام الممارسات المختبرية التي أجريت معقمة وتحت غطاء تدفق الصفحي. قبل البدء ، تأكد من أن أية وسيلة إعلامية غير المتوازنة إلى 37 درجة مئوية ، وبالغاز بشكل مناسب. إعداد أطباق الثقافة Geltrex المغلفة ملاحظة : انظر الملحق لاستخدام الأطباق CELLstart الثقافة المغلفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد أنبوب واحد من Geltrex (1 مل) ببطء في 2-8 درجة مئوية ، وتمييع 1:100 في 99 مل من خروج المغلوب D-MEM/F-12. مزيج الحل بلطف. ملاحظة : بعض خطوط الخلايا المحفزة قد يتطلب التخفيف Geltrex مختلفة لتحقيق النمو الأمثل. انظر التذييل لالتخفيفات البديلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي السطح كله من كل صحن الثقافة مع الحل Geltrex (1 مل عن طبق 35 ملم ، 1.5 مل عن طبق من عيار 60 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم كل طبق مع Parafilm لمنع جفاف واحتضان الأطباق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة : عند هذه النقطة قد تكون لتخزين الأطباق الثقافة Geltrex المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. ختم كل طبق مع Parafilm لمنع Geltrex من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام ونقل الأطباق Geltrex المغلفة إلى غطاء تدفق الصفحي ، والسماح لهم لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 1 ساعة). </li></ol> إعداد وحدة تغذية متكاملة خالية من ريال خروج المغلوب متوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد 1 مل من 10 ميكروغرام / مل حل جمعية جيل المستقبل الأساسية ، مزيج جو معقم و مطهر المكونات المذكورة أدناه. قسامة الحل وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> جمعية جيل المستقبل الأساسية </td><td> 10 ميكروغرام </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 990 ميكرولتر </td></tr><tr><td> جيش صرب البوسنة 10 ٪ </td><td> 10 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> ملاحظة : يمكن أن تكون بديلا BSA HSA مع ريال أو خروج المغلوب في نفس التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحضير 50 ​​مل من 2 الحل Dispase ملغ / مل ، مزيج جو معقم و مطهر المكونات المذكورة أدناه. فلتر تعقيم وتخزين الحل في 4 درجات مئوية لتصل الى 2 أسابيع. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 ملغ </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 50 مل </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحضير 100 مل ريال خروج المغلوب كاملة خالية من الطاعم (KSR - FF) الجمع بين المتوسطة جو معقم و مطهر العناصر المدرجة في الجدول أدناه. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td> الأسهم تركيز </td><td> التركيز النهائي </td><td> حجم </td></tr><tr><td> خروج المغلوب DMEM/F12 (الفئة رقم 12660-012) </td><td> -- </td><td> 1X </td><td> 76.8 مل </td></tr><tr><td> GlutaMAX - I (الفئة رقم 35050-061) </td><td> 200 ملي </td><td> 2 ملم </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> خروج المغلوب ريال (لا Cat.. 10828-028) </td><td> -- </td><td> 20 ٪ </td><td> 20 مل </td></tr><tr><td> خروج المغلوب SR - GFC (الفئة رقم A10580 - 01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td> bFGF (الفئة رقم PHG0024) </td><td> 10 ميكروغرام / مل </td><td> 20 نانوغرام / مل </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> قد قمت بتخزين المتوسطة KSR - FF في درجة مئوية لمدة تصل إلى 2-8 أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل لحظات ما قبل equilibrating المتوسط ​​كاملة لدرجة الحرارة والغازات ، إضافة جو معقم و مطهر حجم المطلوب من 2 المركابتويثانول (55 ملي تركيز الأسهم) لتركيز نهائي 0.1 ملم. على سبيل المثال ، لتحضير 100 مل من KSR - FF المتوسطة إضافة ميكرولتر 182 من 55 مم 2 المركابتويثانول (1:550 تمييع) بدلا من ذلك ، قد تضاف 2 المركابتويثانول لإكمال المتوسطة 1X وتخزينها في درجة مئوية ل08/02 تصل إلى أسبوع واحد. </li></ol> تكييف iPSCs إلى KSR - FF متوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء ، قبل يوازن الخاص أطباق Geltrex المغلفة لدرجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة iPSCs على الخلايا المغذية MEF حتى أنهم متموجة 70-80 ٪. يرجى الرجوع إلى دليل ماوس GIBCO الليفية الجنينية لبروتوكولات الثقافة MEF مقرا لها. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة حجم المطلوب من Dispase في حمام ماء C ° 37. الرجوع الى الجدول 1 أدناه للاطلاع على تفاصيل وحدات التخزين المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوازن حجم المطلوب من KSR - FF في 37 دقيقة for15 ° C حمام الماء. الرجوع الى الجدول 1 أدناه للاطلاع على تفاصيل وحدات التخزين المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسط ​​من أطباق والثقافة ، وإضافة مبلغ مناسب من حل Dispase. احتضان الأطباق على 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل Dispase من كل سفينة الثقافة ويغسل الخلايا المغذية MEF بلطف مع مد برنامج تلفزيوني (2 إلى 3 مرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مبلغ مناسب من اكتمال خروج المغلوب المتوسطة ريال لكل سفينة الثقافة. استخدام مكشطة خلية أو ماصة 5 مل لكشط بلطف خلايا قبالة سطح السفينة الثقافة. ملاحظة : انظر الملحق لبروتوكولات بديلة للتكيف الثابت خطوط الخلايا المحفزة للتكيف ، </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع تعليق خلية من كل صحن الثقافة في أنابيب مخروطية 15 مل منفصلة. شطف كل سفينة الثقافة مع مبلغ مناسب من اكتمال خروج المغلوب المتوسطة ريال ، وإضافة D - PBS شطف المتوسطة في أنابيب مخروطية 15 مل تحتوي على التعليق الخلية. الحرص على عدم كسر كتل الخلايا في الخلايا وحيدة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي ال 15 مل في أنابيب مخروطية 200 x ج لمدة 5 دقائق لiPSCs الكرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونضح من طاف بيليه iPSC. Resuspend الكرية في مبلغ مناسب من KSR - FF المتوسطة وفقا لنسبة الانقسام (الجدول 1). لا كسر كتل الخلية إلى حجم أصغر ، وذلك لأن أصغر كتل لا نعلق البئر إلى السطح. ملاحظة : نوصي نسبة 01:02 لتقسيم المقاطع 3 الأولى بعد أن تم passaged iPSCs مباشرة من الثقافة iPSC متوسطة MEF إلى KSR - FF المتوسط. عادة ، وهي نسبة تقسيم 1:03 حتي 1:05 من المناسب ، ولكن الركض في 01:02 يضمن أعلى كثافة الخلايا عند الحاجة إلى التكيف مع الثقافة المغذية خالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الطلاء وiPSCs على أطباق Geltrex المغلفة ، ونضح المتبقية Geltrex حل من الطبق قبل مغلف بالمطاط ، وإضافة ببطء مبلغ مناسب للتعليق على كل خلية طبق الثقافة. ملاحظة : لا شطف الأطباق قبل الطلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك الطبق الثقافة ذهابا وإيابا ، وجنبا إلى جنب عدة مرات لتفريق الخلايا عبر سطح الطبق. بلطف مكان الطبق الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية مع ترطيب جو من ثاني أكسيد الكربون ٪ 04 حتي 06 فبراير في الهواء. استبدال المتوسطة الذي يقضيه مع KSR - FF كل يوم. </li></ol> الركض الإنسان المحفزة باستخدام خلايا KSR - FF <ol start="13" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة iPSCs البشرية المتزايدة في إكمال KSR - FF تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا هي 70-80 ٪ متكدسة وجاهزة للsubcultured. الرجوع إلى الشكل 1. ملاحظة : إذا أصبحت مستعمرات كثيفة جدا أو كبيرة جدا ، وازدياد التمايز يحدث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع وإزالة أية مستعمرات متباينة iPSC قبل الركض والثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة حجم المطلوب من Dispase في حمام ماء C ° 37. الرجوع الى الجدول 1 أدناه للاطلاع على تفاصيل وحدات التخزين المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوازن حجم المطلوب من KSR - FF في 37 دقيقة for15 ° C حمام الماء. الرجوع الى الجدول 1 أدناه للاطلاع على تفاصيل وحدات التخزين المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسط ​​أمضى من السفينة الثقافة باستخدام ماصة ، وشطف الخلايا مرتين مع مد برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف قبل تحسنت Dispase حل للسفينة الثقافة (على سبيل المثال ، 1 مل من محلول Dispase في صحن الثقافة من عيار 60 ملم). دوامة السفينة الثقافة معطف سطح الخلية بأكملها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان سفينة الثقافة على 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السفينة من الحاضنة ، نضح الحل Dispase ، ويغسل بلطف الخلايا مع مد برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط بلطف خلايا قبالة سطح الطبق الثقافة باستخدام مكشطة الخلية ، ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15mL العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأطباق الثقافة مرتين مع KSR - FF ، بلطف &quot;رش قبالة&quot; أي الخلايا التي لم منفصلة. تجمع شطف المتوسطة مع الخلايا في الأنبوب 15mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لخلايا بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية وتخلص منه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفض الغبار بلطف أنبوب لإخراج تماما بيليه الخلية من أسفل الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend بلطف الخلايا في مرحلة ما قبل معايرتها KSR - FF باستخدام ماصة 5mL المصلية. لا يسحن. ملاحظة : من المهم جدا في خطوة لresuspend بلطف الخلايا من دون استخدام القوة لتجنب الضرر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى صحن Geltrex الطازجة المغلفة من عيار 60 ملم على نسبة الانقسام والتحرك المطلوب الطبق الثقافة ذهابا وإيابا ، وجنبا إلى جنب عدة مرات لتفريق الخلايا عبر سطحه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطبق الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية مع ترطيب جو منثاني أكسيد الكربون 4-6 ٪ 2 في الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، استبدل بلطف المتوسطة الذي يقضيه مع KSR - FF لإزالة الحطام الخلية. استبدال المتوسطة ينفق يوميا بعد ذلك. مراقبة خلايا الجذع والمرور عليهم يوميا حسب الحاجة (تقريبا كل 4-5 أيام). ينصح الركض عندما تصل خلايا التقاء 70-80 ٪. عن الحفظ بالتبريد الخلية الجذع وذوبان الجليد ، لدينا تشير إلى بروتوكول بعنوان &quot;Cryopreserving واسترداد خلايا الجذع من استخدام الإنسان الكامل تغذية خالية من خروج المغلوب استبدال مصل المتوسطة&quot;. </li></ol> النتائج المتوقعة <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. صورة النقيض من المرحلة أدناه iPSCs نمت على أطباق ثقافة Geltrex المغلفة به الطاعم كاملة خالية من خروج المغلوب استبدال المصل المتوسط. ويحمل iPSCs مماثلة لhESCs التشكل ، التي تتميز نواة كبيرة والسيتوبلازم شحيحة. (التكبير 40X) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td> 35mm الطبق </td><td> 60mm الطبق </td><td> 100mm صحن </td></tr><tr valign="top"><td> استكمال خروج المغلوب ريال المتوسطة </td><td> 2 مل </td><td> 4 مل </td><td> 10 مل </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex الحل </td><td> 1 مل </td><td> 1.5 مل </td><td> 4-5 مليلتر </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0.5 مل </td><td> 1 مل </td><td> 3-4 مليلتر </td></tr><tr valign="top"><td> D - PBS للشطف </td><td> 2 مل </td><td> 4 مل </td><td> 10 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 1. أوصت مجلدات <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">الرجاء انقر هنا للاطلاع على التذييل</a> .

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li><li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li></ol>

ويعمل واضعو هذه المادة التي تنتج تقنيات الحياة الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Knockout DMEM/F12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 12660-012</td>
<td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products</td>
</tr>
<tr>
<td>GlutaMAX-I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. No. 35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KnockOut SR, Cat. no. 10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &mu;g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>bFGF, Cat. no. PHG0024</td>
<td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td>
</tr>
<tr>
<td>2-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 21985-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 17105-041</td>
<td>Note: see appendix for alternative passaging methods.</td>
</tr>
<tr>
<td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. A10480-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Tissue Culture Hood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator set at 37&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette-Aid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath set at 37&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60mm Tissue Culture treated dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

feeder-free adaptation, culture and passaging of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

وقد خلق هذا الاكتشاف في 2006 بأن من الممكن إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان والفأر على توليد خلايا الجذع 1-3 بصفات متشابهة بشكل ملحوظ على الخلايا الجذعية الجنينية مصدرا قيما جديدة من الخلايا المحفزة لاكتشاف المخدرات ، والعلاج الخلوي ، والبحوث الأساسية. وقد GIBCO سائل الإعلام والكواشف في طليعة أبحاث الخلايا الجذعية المحفزة لسنوات. خروج المغلوب DMEM تستكمل مع تبديل خروج المغلوب المصل هو وسائل الإعلام المفضلة لنمو الخلايا الجذعية الجنينية والثقافة الآن خلية الجذع 3-9. ويمكن الآن هذا الذهب معيار نظام وسائل الاعلام أن تستخدم لتغذية ثقافة حرة مع إضافة ريال خروج المغلوب عامل النمو كوكتيل. ES الإنسان التقليدية وأساليب زراعة الخلايا المحفزة تتطلب استخدام الفأرة أو تغذية طبقات الخلايا الليفية الإنسان ، أو تغذية مكيفة المتوسط. هذه الأساليب هي ثقافة كثيفة العمالة ، من الصعب على نطاق وأنه من الصعب الحفاظ على الوركين خلايا غير متمايزة نظرا للظروف غير معروف. وقد وضعت Invitrogen خروج المغلوب عامل نمو كوكتيل ريال ليسمح لك بسهولة الانتقال الثقافات صومعتك الوركين لتغذية الحرة مع الحفاظ على استخدامك للريال خروج المغلوب.

Watch this Scientific Journal Video about Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium at JoVE.com

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

بروتوكول التالية توفر التعليم للتكيف الإنسان الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) إلى الخلايا المغذية الثقافة الحرة باستخدام وحدة تغذية كاملة خالية من خروج المغلوب استبدال مصل المتوسطة (KSR - FF). تكييفها مرة واحدة ، كما يتم توفير إرشادات لصيانة مستمرة.

التغذية الخالية من التكيف والثقافة والركض للخلايا البشرية باستخدام IPS الطاعم كاملة خالية من خروج المغلوب استبدال المصل متوسطة

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

feeder-free-adaptation-culture-passaging-human-ips-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

22.3K Views.  Life Technologies.  中文 日本語 

Video: Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

الأشكال الركض الجذعية الجنينية البشرية خلية خطوط مع التربسين

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

ES خلايا الإنسان : ثقافة ابتداء من خلايا مجمدة

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

الركض الخلايا الجذعية العصبية البشرية

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS and hES cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

This protocol describes the detailed procedure for cryopreserving human iPS cells in KnockOut SR cryopreservation medium and recovering these cells in complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium or feeder-based KnockOut SR medium.

Cryopreserving واسترداد خلايا الجذع من الإنسان الكامل باستخدام الضربة القاضية المصل الطاعم خالية استبدال متوسطة

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

كفاءة الجذع الجيل خلية من الدم عن طريق Episomes وHDAC المانعون

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

تحليل مقارن لهرمون النمو البشري في المصل عن طريق سبري، نانو-سبري وELISA فحوصات

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...