وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من برنامج بحوث فرص الدراسة الجامعية في الاتحاد الدولي للدراجات (AR وSP) والمنح المقدمة من الدولة لمبادرة كاليفورنيا مرض الزهايمر والمعاهد الوطنية للصحة منح أي. HD38466 ، ومرض الزهايمر مركز أبحاث منحة لا. AG16573 (JB)

1. الحفظ بالتبريد من كتل الأنسجة القشرية تحضير مواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول ملح 1X هانك في التخزين المؤقت (HBSS) عن طريق تمييع الحل في الأسهم 10X في الماء المعقم (1:9). HBSS المحل في 4oC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ٪ المتوسطة تجميد DMSO بواسطة تمييع DMSO في HBSS (1:9). وينبغي أن يتم تجميد المتوسطة الطازجة قبل الحفظ بالتبريد وتخزينها في 4oC حتى مبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم شفرة حلاقة الصلب لتقطيع منهجي من الأنسجة. قبل الاستخدام ، يتم تعقيمها بواسطة شفرة حلاقة الانغمار في الإيثانول 70 ٪ لمدة 2 ساعة. على الفور قبل معالجة الأنسجة ، وشطف شفرة حلاقة مع الماء المعقم 3 مرات. تجنب ترك الحلاقة في الماء المعقم للحصول على كمية زائدة من الزمن ، كما هي عرضة للأكسدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تحميل الحاويات مع تجميد Nalgene cryovials (2.5 مل) ومن ثم إحضاره إلى مجلس الوزراء بيولوجية معقمة. يضاف 1 مل من المتوسط ​​تجميد مبردة إلى كل قنينة. ثم يتم وضع الحاوية في 4oC تجميد ما لا يقل عن 2 ساعة. </li></ol> التنظيف ، والتقطيع ، والتجميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنظيف أنسجة المخ لتكون الأغشية السحائية المجمدة والأوعية الدموية. نصائح استخدام إبرة معقمة لإزالة الحطام بعناية من النسيج بينما كان يعمل على رأس وضع كيس من الثلج. يجب شطف الأنسجة تنظيفها برفق مع HBSS الباردة ونقل إلى طبق بيتري جديدة لتقطيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل على أعلى وضع كيس من الثلج ، واستخدام شفرة حلاقة معقمة لختم بسرعة النسيج في كتل ما يقرب من 1 3 مم. العمل مع أجزاء صغيرة من أنسجة تنظيفها على نتائج أفضل في الوقت السيطرة على التقطيع الداخلي ، مما أسفر عن أحجام كتلة موحدة أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ببطء الأنسجة المقطعة إلى 50 مل من HBSS في أنبوب مخروطي 50 مل. الشطف بلطف طبق بيتري مع HBSS من أجل جمع أي كتل الأنسجة المتبقية. السماح للكتل الأنسجة أن ينزل إلى أسفل الأنبوب ، وخلق كتلة الأنسجة معبأة فضفاضة بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الأنسجة تسوية ، وجلب الحاويات المبردة سبق تجميدها وcryovials في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إرفع قبعة جميع cryovials للإسراع في عملية إضافة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد كل الكتل الأنسجة استقروا ، نضح بلطف HBSS الزائدة ، وترك طبقة رقيقة جدا من وسائل الاعلام فوق بيليه. تم تخيف الطرد المركزي كما انها سوف تتسبب في كتل الأنسجة التمسك بعضها البعض ، مما يقلل بشكل كبير كفاءة التجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ببطء 200 ميكرولتر من الجزء السفلي من بيليه كتلة الأنسجة فضفاض باستخدام ماصة غيض مع فتحات واسعة (خفض الحافة مع مقص العقيمة). نقل المواد إلى أحد cryovial والانتقال إلى الأنسجة ، وجمع القادم مرة أخرى من الجزء السفلي من بيليه. فمن الضروري أن تخصيص نسيج كامل الإجراء لا يستغرق أكثر من دقيقة 3-4 في حاوية التجمد. هذا يضمن أن ما يتعرض له الأنسجة لDMSO لفترة قصيرة فقط من الوقت قبل التجميد. بعد نقل الأنسجة إلى قارورة ، ومكان الحاوية تجميد في الثلاجة - 80oC مدة لا تقل عن 4 ساعات. بدلا من ذلك ، يمكن ترك الحاوية بين عشية وضحاها في تجميد -80 درجة مئوية. كرر هذه العملية عن أي حاويات تجميد المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحاويات من cryovials تجميد (ق) إلى cryobox ومكان في خزان النتروجين السائل لمدة طويلة الأجل للتخزين. </li></ol> 2. وذوبان كتل مجمدة التثقيف من الأنسجة القشرية تحضير مواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم واحد لعينات الأنسجة ذوبان ، وبولي - L - يسين المغلفة أطباق بتري / coverslips مستعدون. بصفة عامة ، لأننا العصبونات القشرية إعداد أطباق المغلفة مع 500 ميكروغرام / مل أو 1mg / مليلتر. إضافة ما يكفي من بولي - L - حل ليسين (صنع في المخزن بورات) لتغطية كامل الجزء السفلي من الطبق. إذا كانت هناك حاجة coverslips الزجاج ، وضمان أنها غارقة تماما في إطار حل بولي - L - يسين. احتضان ما لا يقل عن 12 ساعة. قبل الاستخدام ، وشطف الأطباق جيدا مع كمية من الماء المعقم ليبرالية 3 مرات ، 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم HBSS الدافئ لتنظيف الأنسجة المذوبة وكذلك لفصل الأنسجة في التعليق الخلية. فإن حجم HBSS حاجة تختلف تبعا لكمية من الأنسجة لتكون تحسنت ، ولكن عادة 1 cryovial سوف تضعف في 50 مل من HBSS وسيتم فصلها في 10 مل من HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسطة Dulbecco في التعديل مع النسر 10 ٪ الحديد العجل البقري تستكمل المصل (EBS) ، و 1 ٪ للمضادات الحيوية / مضاد فطري (AA) خليط (يجب وضع DMEM (++))في حمام مائي 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطلاء المتوسطة (ينبغي بذل NB (+++))الطازجة قبل استخدامها. أعد هذه الوسيلة 1 ٪ عن طريق إضافة المضادات الحيوية / مضاد فطري زائد والمكملات B27 N2. </li></ol> ملاحظة : أسماء وسائل الإعلام إلحاق مع الصلبان (+) تشير إلى إدراج الإضافات لتكوين قاعدة من وسائل الإعلام. في هذا النص ، DMEM (+ +) تعني DMEM EBS زائد 10 ٪ زائد 1 ٪ AA ، بينما يدل NB NB (+++)ررلنا 1 ٪ AA زائد زائد B27 N2. ذوبان الجليد والتثقيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة cryovials من خزان النتروجين السائل وذوبان الجليد بسرعة على 37 درجة مئوية ويلاحظ في حمام مائي حتى مجرد بيليه الثلج الصغيرة داخل محتوى القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل محتوى القارورة بلطف ل50mL من HBSS الدافئة في أنبوب مخروطي. استخدام غيض فوهة واسعة لطرد بلطف أي كتل الأنسجة المتبقية عالقة في cryovial. عكس الأنبوب 3-4 مرات ، والسماح للأنسجة لجمع ببطء في القاع. وينبغي تسوية الأنسجة بسرعة ، ولكن إذا كانت كتل صغيرة جدا وهذا قد لا يحدث والضوء الطرد المركزي (~ 200 × ز) هو الموصى بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح HBSS الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من HBSS الحارة لبيليه الأنسجة و 300 ميكرولتر من التربسين 0.25 ٪ و 50 ميكرولتر من DNAase. تعيين احتضان في حمام مائي 37 ° مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم وضع في المدار شاكر إلى 80 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية ل5 دقائق إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هذه الفترة ، وجلب كتل الأنسجة الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية واستخدام ماصة 10 مل تحرض بعناية كتل الأنسجة حتى يتم تشكيل خلية تعليق غائما. تنشيط التربسين بإضافة 10 مل من DMEM الدافئة (+ +) إلى تعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في فصل ز × 1200 لمدة 5 دقائق. نضح وتجاهل طاف ، resuspend الكرية خلية في 10 مل من DMEM الدافئة (+ +) وتحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا على بولي - L - يسين الأطباق المغلفة. عادة ، سيتم مطلي طبق من عيار 60 ملم مع الخلايا 6 1x10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا لإرفاق الطبق / coverslips لحوالي 1 ساعة في الأنسجة حاضنة الثقافة. فمن المستحسن لرصد التقدم المحرز في مرفق واحد لوحة كل 10 دقيقة حتى لاحظ المرفق الفعال. ثم ، استبدال بلطف المتوسطة مع (++).DMEM جديدة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة ، ويحل محل DMEM (+ +) مع ملاحظة (+++).الدافئة وتجرى التغييرات الجزئية المتوسطة (50 ٪) من أصل كل 5 أيام مع ملاحظة (+++).جديدة ثقافات صحية وعادة ما تظهر علامات التمايز ونمو العمليات بعد 24 ساعة. في ظل هذه الظروف ، وأداء التغييرات الجزئية المتوسطة كل 4-5 أيام ، ويمكن المحافظة على الثقافات لفترات طويلة من الزمن تصل إلى 4-6 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد الخلايا العصبية السلائف (الشخصيات) ، يتم استخدام بروتوكول مماثل باستثناء أنه بعد الطرد المركزي ، ويستخدم DMEM دون EBS. ومطلي الخلايا في قوارير T - 25 في DMEM/F12 (1:3) ، وتستكمل مع B27 EGF (20 نانوغرام / مل) للسماح بتشكيل neuropheres. للتمييز بين الشخصيات ، ومطلي neurospheres على laminin (10 ميكروغرام / مل) coverslips المغلفة في DMEM/F12 (1:3) متوسطة تستكمل مع N2. </li></ol> 3. ممثل النتائج سوف تظهر ثقافات صحية نمو كبير وتمايز بعد 5 أيام بعد ذوبان الجليد ، وسوف تستقر عادة في نموه بنسبة 10 يوما (الشكل 1). تلطيخ Immuncocytochemical من هذه الثقافات ويكشف العديد من الخلايا النجمية (الشكل 2A) والخلايا العصبية (الشكل 2B) للثقافات البشرية والفئران العصبية الأولية. هذا البروتوكول هو أيضا مناسبة لجيل من الشخصيات والتعويم الحر neurospheres (الشكل 3A) ، الذي ظل ظروف التفريق ، نتيجة عالية الجودة في ثقافات متباينة (الشكل 3B ، C). <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. يتم إذابة الثقافات الخلية القشرية من الأنسجة المجمدة الإنسان. مجمدة كتل الأنسجة البشرية القشرية ومطلي على بولي يسين coverslips المغلفة ونمت لمدة 10 يوما. قبل 5 أيام توسيع الخلية هو واضح ، واليوم يتحقق confluency 10. شريط الحجم : 100 ميكرومتر. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تلطيخ Immunocytochemical الثقافات الخلية (أ) كانت ملطخة الثقافات مع الدبقية البروتين الدبقية علامة ييفي الحمضية (GFAP والسهام سميكة). (ب) تم الكشف عن الخلايا العصبية مع الخلايا العصبية ثالثا بيتا تويولين علامة (TIII والسهام رقيقة). (ج) كل من الإنسان والفئران تبين الدبقية الثقافات وفيرة والخلايا العصبية بعد 10 يوما في الثقافة. الابتدائية الأضداد : الماوس المضادة للGFAP (1:1000) والمضادة للأرنب TIII (1:1000). الأجسام المضادة الثانوية : الألغام المضادة للماوس اليكسا 594 (1:500) والمضادة للأرنب اليكسا 488 (1:500). تلطيخ النوى : Hoestch الأزرق (1:1000). شريط الحجم : 50 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. جيل من neurospheres : (أ) تمت معالجة الأنسجة المجمدة على النحو الموصوف أعلاه ، وسمح للنشر وneurospheres. (ب) كانت مطلية Neurospheres coverslips على الزجاج في ظل ظروف التفرقة ونمت لمدة 10 يوما ، مما أدى إلى الخلايا المهاجرة بعيدا عن neurosphere. (ج) كل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية موجودة في توسيع هامش من neurosphere التفريق. counterstaining النووية ، والأجسام المضادة الابتدائية والثانوية كما هو مستخدم في الشكل 2.

<ol>
	<li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+brain+tissue.">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li><li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells.">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li><li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells.">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li><li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium.">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الحفظ بالتبريد يوفر فرصة ثمينة لعينات من أنسجة المخ البنك لاستخدامها في المستقبل. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لكنها فعالة لتوليد كل من الخلايا العصبية التخصيب الثقافات والخلايا العصبية من السلائف المجمدة كتل أنسجة المخ. هذا الإجراء اقتصادية تتجنب تكاليف تقنيات الحفظ بالتبريد التقليدية التي تستخدم أكثر تكلفة سعر المجمدات التي تسيطر عليها. بروتوكول يسمح للجيل الثقافات العصبية قابلة للحياة ما بعد ذوبان الجليد عن طريق توفير وسيلة سريعة لكنها فعالة لتجميد كتل الأنسجة. يمكن لعملية تجميد كامل يستغرق اقل من 20 دقيقة. بالإضافة إلى الثقافات العصبية الأولية ، ويمكن استخدام هذا الأسلوب كتل الأنسجة أيضا إذابة لتوليد الشخصيات كما نمت neurospheres التعويم. في هذا الصدد ، عدم وجود مصل لدينا في المتوسط ​​تجميد يضمن الحفاظ على الخلايا في حالة غير متمايزة. في ظل ظروف التفريق ، أنتجت neurospheres من الأنسجة المجمدة ومعدلات التوسع اظهار تمايز مشابه جدا لneurospheres المتولدة من أنسجة جديدة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995-073</td>
<td>High gluclose 1X</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine calf serum supplemented</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HYCLONE</td>
<td>SH30072.03</td>
<td>For culture medium </td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1088-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>Supplement for Neurobasal medium</td>
</tr>
<tr>
<td>N2 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17502-048</td>
<td>Supplement for Neurobasal medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro </td>
<td>25-054CI </td>
<td>Tissue dissociation</td>
</tr>
<tr>
<td>Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4527-30KU</td>
<td>Tissue dissociation</td>
</tr>
<tr>
<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14065</td>
<td>Cleaning tissue, washes, and freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-L-Lysine- 500mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P2636</td>
<td>Substrate for adhesion of neuronal cells</td>
</tr>
<tr>
<td>antibiotic-antimycotic (100X), liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240-062</td>
<td>To prevent contamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Large orifice pipette Tips (1-200 ul)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>02-681-141</td>
<td>To prevent shear stress to cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Graduated pipette tips (101-1000 ul)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1111-2721</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>21 G1 precision guide needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickinson</td>
<td>305165</td>
<td>To clean tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml pipette </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1071-0810</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>926-9-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single edge razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Smith Brand</td>
<td>67-0238</td>
<td>To chop tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>100 x 15 mm polystyrene petri dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0010</td>
<td>For cleaning tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryogenic box </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5026-1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Freezing container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5100-0001</td>
<td>"Mr. Frosty"</td>
</tr>
<tr>
<td>2.0 ml cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5012-0020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>D128-500</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol 200 proof</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E7023</td>
<td>For sterilizing razor blade</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cryopreservation of cortical tissue blocks for the generation of highly enriched neuronal cultures

في هذه الدراسة ، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول موحد لحفظ البرودة ناجحة وذوبان الكتل القشرية لتوليد أنسجة الدماغ العصبية الثقافات عالي التخصيب. لهذا البروتوكول تجميد المتوسطة المستخدمة سلفوكسيد ثنائي ميثيل 10 ٪ (DMSO) المخفف في محلول ملح هانك في التخزين المؤقت (HBSS). يتم نقل كتل من الأنسجة إلى cryovials القشرية التي تتضمن تجميد المتوسطة والمجمدة ببطء في -1 درجة مئوية / دقيقة في وعاء معدل تسيطر عليها التجمد. بعد تحسن تجهيز وتفكك كتل الأنسجة العصبية المجمدة المنتجة باستمرار التخصيب الثقافات التي أظهرت نموا سريعا لالتهاب الأعصاب خلال ال 5 أيام الأولى في الثقافة والتوسع الكبير في شبكة الخلايا العصبية في غضون 10 يوما. كشفت تلطيخ Immunocytochemical مع نجمي البروتين الدبقية علامة الحمضية ييفي (GFAP) والعصبية علامة تويولين بيتا من الدرجة الثالثة ، أعداد كبيرة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في الثقافات. نتج جيل من الخلايا العصبية الثقافات السلائف بعد تفكك كتلة الأنسجة في التوسع السريع neurospheres ، والتي أنتجت أعدادا كبيرة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في ظل ظروف التفريق. هذا البروتوكول يسمح الحفظ بالتبريد بسيطة للحفاظ على وسريعة فعالة وغير مكلفة لالقشرية كتل أنسجة المخ ، والذي يمنح مزيدا من المرونة لجيل لاحق من الخلايا العصبية ، نجمية ، والثقافات الخلية العصبية السلائف.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures at JoVE.com

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

هنا ، نحن تصف طريقة لحفظ البرودة كفاءة وذوبان الكتل القشرية لتوليد أنسجة الدماغ العصبية الثقافات عالي التخصيب. هذا البروتوكول بسيطة توفر المرونة لجيل لاحق من الخلايا العصبية ، نجمية ، والثقافات الخلية العصبية السلائف.

الحفظ بالتبريد من كتل الأنسجة القشرية للجيل الثقافات متعلق بالخلايا العصبية التخصيب

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

cryopreservation-cortical-tissue-blocks-for-generation-highly

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K Views.  University of California, Irvine. هنا ، نحن تصف طريقة لحفظ البرودة كفاءة وذوبان الكتل القشرية لتوليد أنسجة الدماغ العصبية الثقافات عالي التخصيب. هذا البروتوكول بسيطة توفر المرونة لجيل لاحق من الخلايا العصبية ، نجمية ، والثقافات الخلية العصبية السلائف.

Video: Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

جيل من الخلايا الجذعية العصبية من الأنسجة الجنينية البشرية المهملة القشرية

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

تسجيلات صفيف متعدد القطب من الانهيارات الجليدية الخلايا العصبية في الثقافات عضوي النمط

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

الاشتقاق الثقافات Oligodendrocyte المخصب وOligodendrocyte نيورون / Myelinating المشارك من الثقافات في مرحلة ما بعد الولادة مناديل الفئران

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

نظام آلي بالكامل وذات استخدامات متعددة لاختبار متعدد الوظائف المعرفية وتسجيل أنشطة الخلايا العصبية في القوارض

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

إعداد العصبية المشارك الثقافات واحدة مع الدقة الخليوي

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

الحضانة لفترات طويلة الحادة العصبية الأنسجة للالكهربية والكالسيوم التصوير

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other therapeutic strategies, there is currently no cure available for the injured or diseased brain. Cell replacement appears as a promising therapeutic strategy for neurodegenerative conditions. To this day, neural stem cells (NSCs) have been successfully generated from fetal tissues, human embryonic cells (ES) or induced pluripotent stem cells (iPSC). A process of dedifferentiation was initiated by activation of the novel human GPI-linked glycoprotein, which leads to generation of pluripotent stem cells. These blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) differentiate in vitro into cells with a neural phenotype as shown by brightfield and immunofluorescence microscopy. Ultrastructural analysis of these cells by means of electron microscopy confirms their primitive structure as well as neuronal-like morphology and subcellular characteristics.

We present a genetically modified-free (GM-free) method to obtain cells with a neuronal phenotype from reprogrammed peripheral blood cells. Activation of a signaling pathway linked to novel human GPI-linked protein reveals an efficient GM-free method for obtaining human pluripotent stem cells.

الجيل الخالي من المعدلة وراثيا من الخلايا العصبية المشتقة من الدم

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

مخروط المخصب الثقافات من شبكية العين من أجنة الدجاج لدراسة رود إلى مخروط التفاعلات الخلوية

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and large-scale genomic and drug screening. Due to the self-organizing nature of cells in brain organoids and the growing range of available protocols for their generation, issues with heterogeneity and variability between organoids have been identified. In this protocol paper, we describe a robust and replicable protocol that largely overcomes these issues and generates cortical organoids from neuroectodermal progenitors within 1 month, and that can be maintained for more than 1 year. This highly reproducible protocol can be easily carried out in a standard tissue culture room and results in organoids with a rich diversity of cell types typically found in the developing human cortex. Despite their early developmental make-up, neurons and other human brain cell types will start to exhibit the typical signs of senescence in neuronal cells after prolonged in vitro culture, making them a valuable and useful platform for studying aging-related neuronal processes. This protocol also outlines a method for detecting such senescent cells in cortical brain organoids using senescence-associated beta-galactosidase staining.

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

In this study, we provide a detailed technique for a simple yet robust cortical organoid culture system using standard feeder-free hPSC cultures. This is a rapid, efficient, and reproducible protocol for generating organoids that model aspects of brain senescence in vitro.

جيل قوي وقابل للتكرار للغاية من عضويات الدماغ القشرية لنمذجة الشيخوخة العصبية الدماغية في المختبر

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...