السكتة الدماغية هي حالة سريرية تتميز hypoperfusion من أنسجة الدماغ والنتائج في فقدان الخلايا العصبية. تشير العديد من الأدلة إلى أن التفاعل بين خلايا غليا والمبولة يمارس تأثيرات الضغط بعد حدوث حدث نقص تروية. من أجل استكشاف آليات الحماية المحتملة، من المهم تطوير نماذج تسمح بدراسة التفاعلات العصبية-غليا في بيئة نقص تروية.
هنا نقدم نهجا بسيطا لعزل الخلايا الفلكية والخلايا العصبية من قشرة الجنين الفئران، وذلك باستخدام وسيلة ثقافية محددة يسمح بإنشاء الثقافات العصبية أو استروينست أو الثقافات الجديدة غليا مع ارتفاع العائد والتكرار. لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية، نقترح نهجا، على أساس نظام الثقافة المشتركة، التي يتم الحفاظ على الخلايا العصبية المستزرعة في زلات الغطاء في اتصال مع أحادية من الخلايا الفلكية مطلية في لوحات متعددة جيدا. حافظت الاثنان ثقافة جزء بصغيرة برافين مجالات.
يسمح هذا النهج بالتلاعب المستقل وتطبيق علاج محدد على كل نوع من أنواع الخلايا ، مما يمثل ميزة في العديد من الدراسات. لمحاكاة ما يحدث أثناء السكتة الدماغية، وتخضع الثقافات إلى الأكسجين والجلوكوز بروتوكول الحرمان. يمثل هذا البروتوكول أداة مفيدة لدراسة دور التفاعلات العصبية-غليا في السكتة الدماغية.
ابدأ بعزل قشرة الجنينية للفئران. تم الحصول على الأجنة من عائلة من الفئران في 15 يوما من الحمل ويتم وضعها في أنبوب فالكون العقيمة التي تحتوي على PBS. لا تزال داخل أجنة كيس الصفار توضع داخل طبق بتري يحتوي على PBS الباردة.
مع مساعدة من مقص والملاقط، وكسر كيس صفار، ويتم إزالة الجنين ووضعها في طبق آخر بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة على حزمة الثلج. من الضروري أن نكون حذرين للغاية عند كسر كيس الصفار لا لتلف الجنين. ضع الجنين تحت مجهر تشريح، وأصلح الجنين بلطف باستخدام الـ twizzer.
يجب أن يكون الشق الأولي موازياً للقشرة. يجب الحرص على عدم قطع رأس الحيوان. فروة الرأس ويتم إزالتها بعناية لا لتلف أنسجة الدماغ القشرية.
هذا الشق القادم يفصل القشرة إزالة الأوعية الدموية الموجودة في الأنسجة. وأخيرا، باستخدام ماصة، نقل الأنسجة القشرية إلى أنبوب فالكون مع برنامج تلفزيوني.
يتم الحصول على تعليق الخلية الواحدة من خلال الهضم الميكانيكي للأنسجة الدماغية القشرية باستخدام نصائح مع انخفاض القطر. تأكد من أن الأنسجة متجانسة جيدا بعد الهضم، والطرد المركزي المواد في 400 Gs لمدة ثلاث دقائق. تجاهل الماوسين، وإعادة تعليق الرواسب في وسط الثقافة، ارتفعت درجة الحرارة سابقا إلى 37 درجة.
حساب العدد الإجمالي للخلايا الموجودة في التعليق باستخدام غرفة Neubauer وإعداد التخفيف لكثافة الخلايا الكافية. وأخيرا، بذور الخلايا في متعدد جيدا واحتضان في 37 درجة. من أجل إعداد المواد لنظام الثقافة المشتركة، تسخين البارافين في كتلة التدفئة حتى يصبح السائل.
ثم، مع مساعدة من ماصة بستريو الزجاج باستور إعداد المجالات الصغيرة على زلات الغطاء التي كانت وضعت سابقا في بئر متعددة، ومغلفة مع بولي-D-ليسين. 24 ساعات قبل يتم إحضارها الثقافات اثنين في الاتصال, تغيير وسيلة الثقافة من الخلايا العصبية وstrocytes لتكملة ذلك NBM مع أو بدون الحرارة المعطل FBS. عندما تكون الثقافتان جاهزتين للاستخدام ، قم بنقل الخلايا العصبية ، الجالسة في الغطاء مع قسائم البارافين إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا الفلكية باستخدام ملاقط مغمورة سابقًا في الإيثانول بنسبة 70٪.
بعد وضع كلا النوعين الخلية في الاتصال، انتظر من 8 إلى 12 ساعة، ومن ثم بدء المحفزات المختلفة والإجراءات. يتم تنفيذ الحرمان من الأكسجين والجلوكوز في ثقافة مع سبعة أيام من النمو. إزالة المتوسطة الثقافة، وغسل الخلايا مرتين مع HBSS المتوسطة دون مكملات الجلوكوز.
تأكد من غسل جميع الوسيلة التي تحتوي على الجلوكوز. ختم غرفة نقص الأكسجة وإضافة مزيج الغاز التي تحتوي على 95٪ من النيتروجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع دقائق مع تدفق 20 لترا للدقائق من أجل استبدال الأكسجين الموجود داخل الغرفة. ثم، وقف تدفق ووضع غرفة نقص الأكسجة في حاضنة في 37 درجة.
بعد فترة من الحرمان من الأوكسجين والجلوكوز، واستبدال المتوسطة، HBSS دون مكملات الجلوكوز مع وسيلة الثقافة المناسبة للإجراءات المتبقية واحتضان الخلايا في 37 درجة. من أجل توصيف نوع من الثقافة القشرية، قمنا بإجراء الكيمياء المناعية في الأنواع الثلاثة من الثقافات القشرية لتقييم عدد الخلايا التي أعرب عن GFPA أو MAP2، والتي هي علامات تستخدم على نطاق واسع للخلايا الفلكية والخلايا العصبية على التوالي. وكشف هذا التحليل أنه عندما هذا البروتوكول، كنا قادرين على الحصول على ثقافة نقية المخصب من الخلايا الفلكية مع حوالي 97٪ من الخلايا التي تعبر عن GFAP.
فيما يتعلق بثقافة الخلايا العصبية المخصب، قمنا بالتحقق من حوالي 78٪ من الخلايا التي تعبر عن MAP2. ومع ذلك فإننا نحدد حوالي 18٪ من الخلايا السلبية GFAP و MAP2. بالنسبة لثقافة الخلايا العصبية-glia القشرية, لوحظ أن حوالي 49٪ من الخلايا هي خطة ماب2 إيجابية.
31٪ هي GFAP إيجابية. و 20٪ انهم ليسوا مسؤولين عن GFAP ولا MAP2. بعد سبعة أيام من مؤسسة الثقافة القشرية ، خضعت ثقافة الخلايا العصبية -glia والثقافة الغنية بالخلايا العصبية لإجراء OGD لمدة 4 و 6 ساعات.
بعد هذا الإجراء، تم تصنيف الخلايا بـ MAP2 ثم تم تحديد عدد الخلايا الإيجابية MAP2 باستخدام المجهر الفلوري. في ثقافة الخلايا العصبية-glia, لوحظ انخفاض حوالي 30٪ في عدد الخلايا العصبية, عندما تم تقديم الثقافة إلى فترة OGD من 4 ساعات. بعد فترة OGD من 6 ساعات ، يزيد امتداد الآفة ، ليصل إلى حوالي 60 ٪ من فقدان الخلايا العصبية.
فيما يتعلق بالثقافة المخصب من الخلايا العصبية المعرضة لـ OGD ، لوحظ حوالي 41٪ و 64٪ انخفاض في عدد خلايا MAP2. وعلاوة على ذلك، لوحظ أن في الثقافة المخصب بالخلايا العصبية، كان هناك زيادة طفيفة في تمديد الإصابة بالمقارنة مع ثقافة الخلايا العصبية-غليا التي تتعرض أيضا لـ OGD خلال 4 ساعات. في الختام، هنا تمثل نموذجا في المختبر لدراسة السكتة الدماغية الإقفارية التي أنشئت بطريقة بسيطة وسريعة ومكلفة وقابلة للتكرار.
بالإضافة إلى ذلك، الطريقة المذكورة يسمح أيضا لتنفيذ الخلايا العصبية والثقافات الأولية المخصب الفلكية، ولكن أيضا ثقافة الخلايا العصبية-غليا. وهكذا، وتوفير نموذج كبير في المختبر لنمجة العديد من أمراض الدماغ مع مستوى أعلى من التعقيد، من خطوط الخلايا الخالدة والخلايا العصبية النقية أو الثقافات الدبقية.
