1. إعداد صك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مقياس التألق الطيفي والسماح لالاحماء لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام Excel إنشاء ملف مع المعايير ونموذج البيانات ، كما هو مبين في الشكل (1) وحفظه في قيم مفصولة بفواصل &quot;CSV&quot; تنسيق. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. المعايير وبيانات العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مقياس التألق على النحو التالي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="رمز 1" /> زر ، وهذا فتح نافذة أسلوب التحليل ، كما هو موضح في الشكل رقم 2. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. نافذة تحليل الأسلوب ، التبويب عام. بإجراء التحديدات التالية : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان &quot;القياس&quot; ، حدد قياس الشدة الضوئية من سحب أسفل القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الحقل &quot;المشغل&quot; ، أدخل اسم المشغل المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليست هناك حاجة لإدخال المعلومات في هذا المجال &quot;الصك&quot;. يتم تحديد هذا تلقائيا بواسطة البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;المعاينة&quot; حقل غير نشط عند استخدام قارئ microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال أية تعليقات التي قد تريد تضمينها في التقرير في هذا المجال &quot;تعليقات&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان &quot;ملحقة&quot; ، أدخل المعلومات المتعلقة الملحقات المستخدمة في هذا الاختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحظ الأزرار على الجانب الأيمن من النافذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;تحميل&quot; الزر يتيح تحميل أساليب التحليل التي تم حفظها سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;حفظ&quot; زر يسمح بتحديث مجموعة من المعلمات اختبار أو الطريقة التي تم حفظها سابقا التحليل وتحميلها ، وذلك باستخدام نفس الاسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;حفظ باسم&quot; الزر يتيح توفير مجموعة جديدة من المعلمات اختبار أو أسلوب التحليل تحت الاسم المطلوب. </li></ul> الآن انقر فوق علامة التبويب &quot;الكميات&quot; ، انظر الشكل رقم 3 وجعل التحديدات التالية. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. نافذة تحليل الأسلوب ، التبويب الكميات. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان &quot;الكميات نوع&quot; ، حدد الطول الموجي. يشير هذا وسوف تتاح القراءة مضان باستخدام الطول الموجي المحدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان &quot;معايرة نوع&quot; ، حدد 1 ترتيب الحادي والعشرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الحقل &quot;عدد من موجات&quot; ، حدد 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان &quot;تركيز وحدة&quot; ، أدخل نانوغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجازة غير محددة خانات &quot;لمعايرة يدوي&quot; و &quot;القوة من خلال منحنى الصفر&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;الأرقام العشرية بعد نقطة&quot; الحقل ، حدد 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان &quot;السفلى تركيز الحد&quot; ، أدخل 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;أعالي تركيز مجال الحد ، أدخل 10000. </li></ul> الآن انقر على علامة التبويب &quot;الصك&quot; وجعل التحديدات التالية. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. تحليل أسلوب النافذة ، التبويب الصك <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;وضع البيانات :&quot; حقل ، حدد الإسفار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;سرعة التقطيع&quot; حقل غير نشط في هذا الوقت ، يتم استخدامه فقط لقياس تفسفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان &quot;الموجي النمط&quot; ، حدد كلا WL الثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان &quot;EX / WL1&quot; دخول 480nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;EM / WL1&quot; حقل إدخال 520nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كافة الحقول الأخرى بموجب EX وEM غير نشطة في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;شق EX&quot; حقل حدد 5.0nm سحب من أسفل القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;شق EM&quot; حقل حدد 5.0nm سحب من أسفل القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجازة غير محددة المربع أمام &quot;الجهد PMT 1 - 1000V&quot; الميدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;PMT الجهد&quot; الحقل ، حدد 700V سحب من أسفل القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;كالك سيارات الإحصائية. رقم&quot; حقل حدد 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مجال &quot;يعيد&quot; حدد 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان &quot;تكامل الوقت&quot; حدد 0.1s &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الحقل &quot;تأخير&quot; أو تحديد دخول 0s. </li></ul> انقر فوق علامة التبويب &quot;مراقب&quot;. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. تحليل أسلوب النافذة ، التبويب مراقب. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;محور Y&quot; ، &quot;الحد الأقصى :&quot; حقل ، حدد 10000 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;محور Y&quot; ، &quot;الحد الأدنى :&quot; حقل ، حدد 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المربع الموجود على يسار &quot;فتح تجهيز البيانات بعد الحصول على البيانات&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجازة غير محددة المربع الموجود على يسار &quot;طباعة التقرير بعد الحصول على البيانات&quot; ، إلا إذا كنت تريد التقرير المراد طباعتها تلقائيا بعد الانتهاء من القراءات. </li></ul> انقر فوق علامة التبويب &quot;تقرير&quot; ، انظر الشكل 6. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6. تحليل أسلوب النافذة ، تبويب التقرير. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الميدان &quot;إخراج&quot; ، حدد تقرير طباعة من القائمة المنسدلة. هل يمكن أيضا تحديد &quot;استخدام تعليمات Microsoft Excel&quot; إذا كنت تريد أن البيانات التي تم تصديرها إلى Excel ، أو &quot;مولد طباعة ورقة استخدام&quot; في حالة استخدام الوظيفة اختياري على مولد تقرير البرنامج الذي سيسمح توليد مخصص التقارير المقدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق خانات للعناصر التي تريد إدراجها في التقرير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحفظ جميع المعلمات في تحديد علامات تبويب مختلفة من النافذة &quot;تحليل أسلوب&quot; ، انقر مرة أخرى على علامة التبويب &quot;عام&quot; وحفظها تحت اسم ملف ومكان حيث يمكن العثور عليها لاستخدامها في المستقبل ، وانقر على &quot; موافق &quot;الزر لإغلاق هذه النافذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا اكتمال إعداد المعلمات اختبار الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن سنقوم بإعداد microplate القارئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="رمز 2" /> زر ، والذي سيجلب إطار الإعداد MPR على القمة. </li></ul> حدد آبار للمواصفات والعينات في إطار التبويب MPR / اللوحة الإعداد ، كما هو مبين في الشكل 7. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="الشكل 7" /> الشكل 7. MPR إطار الإعداد ، التبويب اللوحة. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على موقف A1 واسحب الماوس لE1 ، ثم انقر على <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="رمز 3" /> الزر. وهذا اختيار المواقف التي ستستخدم لهذه المعايير. وسيتم تسليط الضوء تلك المواقف في اللون الأخضر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن نحن بحاجة لتحديد المواقف F1 لH3 للعينات. انقر واسحب الماوس بدءا F1 في الموقف ، لوضع H3 ثم انقر على <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="رمز 4" /> زر ، وتسليط الضوء على هذا تلك المواقف في اللون الأصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم كرر العملية نفسها للمناصب لE3 A2 ، لتحديد تلك المواقف لقياسات العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، دعونا تحميل ملف الفاصلة المفصولة متغير (CSV) ملف معدة مسبقا مع المعايير والمعلومات نموذج. </li></ul> انقر على &quot;حسنا المعلومات&quot; التبويب &quot;نافذة الإعداد MPR&quot; ، كما هو مبين في الشكل 8. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="الشكل 8" /> الشكل 8. MPR إطار الإعداد ، حسنا التبويب معلومات. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم انقر على <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="رمز 5" /> الزر. وهناك نافذة مفتوحة ويندوز اكسبلورر الذي كما هو مبين في الشكل 9 ، الأمر الذي سيتيح تحديد مكان وجود &quot;حسنا information.csv&quot; ملف وتحميله. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="الشكل 9" /> الرقم 9. كذلك تحميل معلومات العينة. بعد تحميل &quot;حسنا معلومات&quot; الملف ، فإن &quot;المعلومات حسنا&quot; تبدو كما هو مبين في الشكل 10 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="الرقم 10" /> الرقم 10. تحميل معلومات العينة جيدا. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. Picogreen تحضير عينة الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1X TE العازلة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملم EDTA) وذلك بإضافة 1 مل من 20 العازلة TE Xإلى 19 مل دي H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول الكاشف PicoGreen بإضافة 50 ميكرولتر 200 الكاشف PicoGreen X ل9.95 مل 1 العازلة TE X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معايير (لامدا dsDNA) بجعل التخفيفات المتسلسلة لdsDNA الأسهم (100 ميكروغرام / مل). إعداد أول حل من 50 ميكروغرام / مل dsDNA بإضافة 25 ميكرولتر من dsDNA الأسهم (100 ميكروغرام / مل) و 25 ميكرولتر 1 العازلة TE س. ثم تعد الحلول القياسية من خلال إضافة وحدات التخزين من dsDNA وأشار العازلة كما هو موضح في الجدول أدناه : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> تركيز dsDNA </td><td> حجم dsDNA </td><td> حجم الاحتياطي </td></tr><tr><td> 1 ميكروغرام / مل </td><td> 20 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل dsDNA </td><td> 980 ميكرولتر 1 X TE العازلة </td></tr><tr><td> 0،1 ميكروغرام / مل </td><td> 100 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل dsDNA </td><td> 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة </td></tr><tr><td> 0.01 ميكروغرام / مل </td><td> 100 ميكرولتر من 0،1 ميكروغرام / مل dsDNA </td><td> 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة </td></tr><tr><td> 0،001 ميكروغرام / مل </td><td> 100 ميكرولتر من 0.01 ميكروغرام / مل dsDNA </td><td> 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. قياس المعايير والإسفار نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 150 ميكرولتر من كل معيار في آبار A1 - E1 من 96 لوحة جيدا ، في الشكل 7 ، وفقا للجدول التالي : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> جيد </td><td> معيار </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0،1 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0.01 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0،001 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X TE العازلة </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 150 عينات غير معروفة في ميكرولتر F1 الآبار لH3 ، كما هو موضح في الشكل 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حل PicoGreen أعدت في الخطوة 1.2 في حوض مصمم للاستخدام ماصة متعدد القنوات. استخدام ماصة متعدد القنوات لتقديم حل PicoGreen 150 ميكرولتر من الآبار A1 - H3. حل المزيج بلطف مع المعايير وماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة في مكان مظلم ومنطقة الانتظار 2-5 دقائق للرد على تطوير. </li></ol> 4. ممثل النتائج يتم تقييم منحنى المعايرة جيدة باستخدام معلمات مختلفة يقدمها البرنامج F - 7000 على قياس المعايير وحساب منحنى المعايرة بواسطة البرنامج. معامل تقرير يشير الى الخير من يصلح لمعايير قياس والمعايرة منحنى المحسوبة. وهذه القيمة هي أقرب إلى &quot;1&quot; ، وأفضل تناسب قيمة قياس والمعايرة منحنى. إذا كانت القيمة هي أبعد ما تكون عن &quot;1&quot; ، لا بد من اعادة قياس المعايير ، التي أعدت مرة أخرى ، أو تغيير اللياقة البدنية للمنحنى المعايرة. ويبين الشكل 11 مثال على منحنى المعايرة مع احتساب معامل عزم = 0.99993 ، وحصل على تقدير من dsDNA باستخدام PicoGreen صباغة. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="الرقم 11" /> الرقم 11. مثال على منحنى المعايرة dsDNA.

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li></ol>

ويعمل لويس مورينو ألف ولام كوكس كندرا تكنولوجيز التي كتبها هيتاشي أمريكا السامية التي تنتج الأداة المستخدمة في هذه المقالة.

pipetting الحذر أثناء إعداد العينات ، وكذلك باستخدام معمل مستقرة وحساسة مضان ضروري للحصول على نتائج جيدة وقابلة للتكرار. في قضية معمل مضان يستخدم لهذا الاختبار ، يقترح استخدام 300 ميكرولتر حجم العينة النهائية في القارئ microplate. انخفاض حجم يقلل من الحساسية ، وزيادة حجمها قد يسبب التلوث المتبادل بين الآبار.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Distilled H2O</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>P7589</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>237108</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12 Channel Eppendorf Micropipette</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3516677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1000 &mu;L Eppendorf Pipette</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>200 &mu;L Eppendorf Pipette </td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mL serological pipet</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum foil</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette tips</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5J1-0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microplate Reader Accessory for F-7000</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5J0-0139</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantification of dsdna using the hitachi f-7000 fluorescence spectrophotometer and picogreen dye

الكمي من الحمض النووي ، وخصوصا في تجمعات صغيرة ومهمة هامة مع مجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك المعايير البيولوجية المقايسات البيولوجيا الجزيئية مثل تجميع وتنقية من الحمض النووي ، والتطبيقات التشخيصية مثل الكمي للمنتجات تضخيم الحمض النووي ، والكشف عن جزيئات الحمض النووي في قضايا المخدرات التحضيرات. خلال هذا الفيديو سوف نظهر قدرة الطيف هيتاشي F - 7000 الإسفار مجهزة التبعي بلايت القارئ الصغير لأداء dsDNA الكمي باستخدام المسابر الجزيئية كوانت ، أنه كاشف صبغ PicoGreen عدة. في الطيف F - 7000 الإسفار عروض حساسية عالية وقياسات سرعة عالية. وهو نظام مرن للغاية قادرة على قياس مضان ، التألق ، وتفسفر. طرق قياس عدة متاحة ، بما في ذلك فحص الطول الموجي والمسح الضوئي الوقت ، وقياس الضوء وقياس 3 - D الفحص. معمل لديه حساسية في مجموعة من 50 من picomoles فلوريسئين عند استخدام حجم العينة 300 ميكرولتر في microplate ، وقادر على قياس سرعة فحص 60000 نانومتر / دقيقة. كما أن لديها مجموعة واسعة ديناميكية تصل إلى 5 أوامر من حجمها والذي يسمح لاستخدام منحنيات المعايرة على طائفة واسعة من التركيزات. نظام بصري يستخدم كل البصريات الانعكاسية للطاقة القصوى والحساسية. النطاق الموجي هو معيار 200-750 نانومتر ، ويمكن أن تمتد إلى 900 نانومتر عند استخدام واحدة من photomultipliers اختياري الأشعة تحت الحمراء القريب. ويسمح نظام التحكم في درجة الحرارة اختياري للقارئ لوحة 5-60 درجة مئوية درجة الحرارة باستخدام اختياري للرقابة الخارجية دائري السائل. القارئ microplate يسمح للاستخدام من 96 microplates جيدا ، وقياس سرعة لمدة 96 بئرا أقل من 60 ثانية عند استخدام النمط حركية. ضوابط البرمجيات لF - 7000 ، وقارئ Microplate أيضا درجة عالية من المرونة. قد يتم تعيين العينات في عمود أو صف الأشكال سواء ، ويمكن اختيار أي مجموعة من الآبار للحصول على قياسات العينات. وهذا يسمح للاستخدام الأمثل للmicroplate. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح برنامج استيراد التكوينات الدقيقة لوحة عينة التي تم إنشاؤها في Excel وحفظها في قيم مفصولة بفواصل ، أو &quot;CSV&quot; تنسيق. يمكن حفظ تكوينات Microplate قياس وأشار من قبل البرنامج للحصول على الراحة وزيادة الإنتاجية. يمكن أن يكون الناتج نتائج البيانات لتقرير القياسية ، إلى Excel ، أو إلى تقرير برنامج مولد اختيارية.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye at JoVE.com

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

مظاهرة الكمي للdsDNA باستخدام المسابر الجزيئية PicoGreen صبغ وهيتاشي الطيف الإسفار F - 7000 مجهزة التبعي microplate القارئ.

الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

24.4K Views.  Hitachi High Technologies America. مظاهرة الكمي للdsDNA باستخدام المسابر الجزيئية PicoGreen صبغ وهيتاشي الطيف الإسفار F - 7000 مجهزة التبعي microplate القارئ.

Video: Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

تعيين تركيز الأحماض النووية والبروتينات باستخدام الصغرى ، حجم الطيف نانو بيو المواصفات

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

مطلق قياس العائد الكم من عينات مسحوق

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

تصور انواع معينة ايليجانس</emالهياكل البشرة> استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) مع السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيقات في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Visualization and Quantification of Brown and Beige Adipose Tissues in Mice using [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Brown and beige adipocytes are now recognized as potential therapeutic targets for obesity and metabolic syndromes. Non-invasive molecular imaging methods are essential to provide critical insights into these thermogenic adipose depots. Here, the protocol presents a PET/MR imaging-based method to evaluate the activity of brown and beige adipocytes in mouse interscapular brown adipose tissue (iBAT) and inguinal subcutaneous white adipose tissue (iWAT). Visualization and quantification of the thermogenic adipose depots were achieved using [18F]FDG, the non-metabolizable glucose analog, as the radiotracer, when combined with the precise anatomical information provided by MR imaging. The PET/MR imaging was conducted 7 days after cold acclimation and quantitation of [18F]FDG signal in different adipose depots was conducted to assess the relative mobilization of thermogenic adipose tissues. Removal of iBAT substantially increased cold-evoked [18F]FDG uptake in iWAT of the mice.

Visualization and Quantification of Brown and Beige Adipose Tissues in Mice using [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Functional imaging and quantitation of thermogenic adipose depots in mice using a micro-PET/MR imaging-based approach.

التصور والقياس الكمي للأنسجة الدهنية البنية والبيج في الفئران باستخدام [18F] FDG Micro-PET / MR التصوير

Brown and beige adipocytes are now recognized as potential therapeutic targets for obesity and metabolic syndromes. Non-invasive molecular imaging methods ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

القياس الكمي للمنافسة بين البكتيريا باستخدام التصوير الفلوري أحادي الخلية

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...