نود أن نشكر S. تانيجا - Bageshwar ، Beifuss K. ، Kedroske S. ، والمراكز الصحية. هسياو للمناقشات مفيدة. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق بدء الأموال من وزارة TAMHSC الطب الجزيئي والخلوي. تم شراؤها في نطاق المجمع والقرص الغزل مع الأموال المقدمة من قبل الدائرة ومكتب TAMHSC عميد. وقدمت بعض سلالات من قبل مركز علم الوراثة انواع معينة ، والذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد. وكان pRF4 (رول - 6 (su1006)) هدية من الحرائق أ.

1. إعداد صلاح الغيدان وصمة عار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل سهم الجاذبة ملغ / مل 20 (Biotium ، شركة ، هايوارد ، كاليفورنيا) في DMF. صلاح الغيدان هو الضوء الحساسة وحمايتها حتى من الضوء الجاذبة التي التفاف في احباط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء تخفيف العمل الجاذبة بإضافة 0،6 الأسهم الجاذبة ميكرولتر إلى 399.4 M9 ميكرولتر لكل السكان. هذا يجب أن تعطي تخفيف العمل النهائية من 30 ميكروغرام / مل الجاذبة في M9. يمكن زيادتها لتصل هذه تلطيخ السكان متعددة في وقت واحد. درع الجاذبة من الضوء التفاف الأنبوب (ق) في احباط. </li></ol> 2. إعداد النيماتودا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لوحة 60 ملم تحتوي على عدد سكان الديدان الخيطية غير ملوثة. غسل الحيوانات من لوحة باستخدام حل تريتون 0.5 ٪ X - 100 في M9 العازلة التي يحوم السائل بلطف في حركة دائرية على سطح اللوحة لتخفيف جميع الحيوانات اليرقات وتعليم الكبار. يغسل نقل في أنبوب معقم مل 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور على الفور من الحيوانات عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. إزالة والتخلص من أكبر قدر سوبernatant ممكن من دون إزعاج كتلة الحيوانات في قاع الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من تريتون المتبقية X - 100 ، شطف الحيوانات باستخدام M9 العازلة ، وتدور ، وإزالة طاف. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 ميكروليتر من محلول الجاذبة العاملة في M9 في أنبوب لفترة وجيزة إلى دوامة resuspend الحيوانات في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هز أنبوب عند 20 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أفقيا في 350 دورة في الدقيقة في بيئة محمية الضوء. إذا رغبت في ذلك ، يمكن المحتضنة الحيوانات تصل إلى 16 ساعة للتلوين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقليل كمية من الصبغة غير منضم ، وتدور باستمرار على الحيوانات في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية. إزالة وتجاهل وطاف أكبر قدر ممكن من دون إزعاج كتلة الحيوانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الحيوانات في 400 العازلة M9 ميكرولتر وسكب السائل على جزء البكتيريا خالية من طبق آغار NGM المصنف مع E. OP50 القولونية. سماح للحيوانات لاسترداد ما لا يقل عن 30 دقيقة. خلال فترة الانتعاش ينبغي أن الحيوانات الزحف بعيدا عن السائل تلطيخ الجاذبة وعلى الطعام. هذه الخطوةمضان الخلفية يقلل من الجاذبة الحرة. </li></ol> 3. تصاعد ومراقبة العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آغار تذوب في الماء 4 ٪ باستخدام الأوتوكلاف أو ميكروويف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء الفواصل التي يعاد استخدامها ، والتي يمكن استخدامها لضمان سمك موحد لوحة آغار ، من خلال طبقات قطعتين من الشريط مختبر على شريحة زجاجية. هل جعل الشرائح two الإجمالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب شريحة زجاجية نظيفة بين الشرائح هل اثنين. ماصة حوالي 150 ميكروليتر (أربع نقاط) من 4 ٪ المنصهر أغار على مركز للشريحة زجاجية نظيفة. تغطية بسرعة آغار المنصهر باستخدام شريحة إضافية لتشكيل لوحة آغار. إزالة الغطاء بعناية الشريحة ، والحفاظ على وسادة تركز على الجزء العلوي من الشريحة المتزايدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة حوالي 5 ميكرولتر من مخدر الخيطية (100 ميكرون -- 1 levamisole ملم ، على سبيل المثال) على وسادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل 8-12 الحيوانات في التخدير ، وتغطي مع ساترة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الحيوانات باستخدام المجهر المركب أو مبائر مزودة objecti على الأقل 40X<html> لقد وDSRed / TRITC (أو غيرها متوافق) التصفية. الحد الأقصى من الإثارة مضان الجاذبة هو 549 نانومتر ، والحد الأقصى من الانبعاثات هو 565 نانومتر لصبغ منضم (Biotium ، شركة ، هايوارد ، كاليفورنيا). </li></ol> 4. ممثل النتائج البقع الجاذبة للبشرة من نوع جيم البرية ومتحولة ايليجانس. دعا التلال طولية جليدية على سطح يحتوي على فصل للحلقة التي الأخاديد وكفافي ، في بعض المراحل ، جناح الكبير. كل مرحلة تنموية وهياكل جليدية مع تركيبات مختلفة 2. التلال أو الأخاديد كل من أجنحة وصمة عار للحلقة fluorescently ، اعتمادا على تكوين سطح ، طوال مراحل اليرقات والكبار وتبقى مرئية حتى بعد يوم من استرداد باستخدام هذا الأسلوب. ولوحظت بقع الفلورسنت الخلفية في بعض الأحيان (أرقام 2F ، G) ، ولكن ليس بشكل روتيني. (الشكل 1 ، الشكل 2A - E ، H ، I) وقد اتخذت كافة الصور مع مبائر القرص أو الغزل ، وعندما لاحظت ، widefield المجهر المركب (WF). الأنف والحنجرة &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig1.jpg" /> الشكل 1. البقع الجاذبة بشرة والخلايا العصبية المعرضة بيئيا. L2 المرحلة الحيوانية. 630x التكبير. تم القبض على قطع الفسيفساء باستخدام صورة iVision ماك البرمجيات (BioVision تكنولوجيز ، إكستون ، والسلطة الفلسطينية). وانضم الصور باستخدام أدوبي فوتوشوب CS3 ​​(أدوبي سيستمز ، سان خوسيه ، كاليفورنيا). شريط النطاق = 10 ميكرون. الجاذبة أيضا fluorescently البقع والخلايا العصبية الحسية amphid فصمية في الرأس والذيل على التوالي (سهام علامة بعض). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig2.jpg" /> الشكل 2. الجاذبة البقع fluorescently جيم ايليجانس جليدة في جميع مراحل تطور الجنين في مرحلة ما بعد. 630x التكبير. شريط النطاق = 10 ميكرون. تلون من النوع البري والحيوانات في L1) ؛ ب) L2 ، C) dauer ؛ D) L3 ؛ E) L4 ، وF) في المراحل الكبار. هي ملطخة fluorescently التلال أجنحة والحلقي في الحيوانات وL1 dauer (A ، C). بقع التلال الحلقي الجاذبة في الحيوانات L2(B). الحلقي الأخاديد وصمة عار في L3 L4 والحيوانات (D ، E). في الأخاديد من جناح الكبير والملون للحلقة في الحيوانات الكبار (FH). وتتكون من اثنين من أجنحة التلال الخمس ، أو ثلاث ، (في L1 ، dauer ، أو الحيوانات البالغة على التوالي) ، التي تعمل على طول الحيوان (الأسهم) 16. للحلقة خلق التلال كفافي حول الحيوانية (النصال وواو وياء). إهاب الحيوانات طافرة الكبار العرض المعتدلة عيوب المنظمة جليدية (GH). G) ومرتفعات من أجنحة متقطعة (WF). H) وتنصهر التلال أجنحة الزائدين ومتشعبة متفرعة أو (WF). المسوخ الجين الكولاجين المعرض أجنحة وعيوب التنظيم الحلقي (IJ). I) في الحيوانات المعدلة وراثيا overexpressing pRF4 (رول - 6 (su1006)) ، التلال تكمن جناح الكبير في زاوية لطول الحيوان. J) للحلقة المعدلة وراثيا في pRF4 overexpressing الحيوانات (رول - 6 (su1006)) عرض على نمط منتظم. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig3.jpg" /> الشكل 3. خارجيهي مضيئة بن هياكل شكلية بواسطة تلطيخ الجاذبة. 630x التكبير. أشرطة النطاق = 10 ميكرون. الجاذبة كما يبرز المزايا الخارجية الأخرى ، بما في ذلك A) أشعة الكبار الكبار خنثى الفرج ، B) ومروحة الذيل الذكور ، وجيم). خنثى ارتفاع الذيل (متشعب في هذه الخلفية متحولة) <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig4.jpg" /> الشكل 4. البشرة وقتا أطول لطخه مع صلاح الغيدان من الخلايا العصبية المعرضة بيئيا. 630x التكبير. شريط النطاق = 10 ميكرون. بعد ساعتين من تلطيخ ، ملطخة بما فيه الكفاية amphid (لا يظهر) والخلايا العصبية الحسية فصمية (الأسهم). في المقابل ، إهاب الأصغر سنا حيوانات ليست سوى جزئيا في بقع ملطخة (رأس السهم). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> غسل </td><td> وصمة عار حل (+ الجاذبة) </td><td> حضانة الوقت </td><td> بشرة ملون </td></tr><tr><td> M9 آر + 0.5 ٪iton X - 100 </td><td> M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 </td><td> 2 ساعات </td><td> لا </td></tr><tr><td> M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 </td><td> M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 </td><td> 3 ساعات </td><td> لا </td></tr><tr><td> M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 </td><td> M9 </td><td> 2 ساعات </td><td> جزئي </td></tr><tr><td> M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 </td><td> M9 </td><td> 3 ساعات </td><td> نعم </td></tr><tr><td> M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 </td><td> H 2 0 </td><td> 2 ساعات </td><td> جزئي </td></tr><tr><td> M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 </td><td> H 2 0 </td><td> 3 ساعات </td><td> نعم </td></tr></tbody></table> الجدول 1. تم اختبار تلطيخ جليدية تحت ظروف مختلفة. حضانة حلول مختلفة ومرات لتحسين تلطيخ جليدية في الحيوانات. H 2 0 ، ماء مقطر معقم. تلطيخ جزئية تشير تلطيخ متفاوتة من إهاب اليرقات (الشكل 4) ، على الرغم من البقع بشرة الكبار جonsistently.

<ol>
	<li>Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+of+Caenorhabditis+elegans:+its+isolation+and+partial+characterization.">Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).</li><li>Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle+of+Caenorhabditis+elegans.+II.+Stage-specific+changes+in+ultrastructure+and+protein+composition+during+postembryonic+development.">The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development.</a> Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).</li><li>Hall, D., Altun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans Atlas. , (2008).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> The C. elegans Research Community. , (2007).</li><li>Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sqt-1+gene+of+C.+elegans+encodes+a+collagen+critical+for+organismal+morphogenesis.">The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis.</a> Cell. 55, 555-565 (1988).</li><li>Mende, N. v. o. n., Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dpy-13:+a+nematode+collagen+gene+that+affects+body+shape.">dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape.</a> Cell. 55, 567-576 (1988).</li><li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+surface+proteins+of+wild+type+and+mutant+Caenorhabditis+elegans.">Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).</li><li>Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+actin+filaments+in+patterning+the+Caenorhabditis+elegans+cuticle.">The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle.</a> Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).</li><li>Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zona+Pellucida+domain+containing+proteins,+CUT-1,+CUT-3+and+CUT-5,+play+essential+roles+in+the+development+of+the+larval+alae+in+Caenorhabditis+elegans.">The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).</li><li>Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+collagen+genes.+Expression+in+Caenorhabditis+elegans.">Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Genet. 16, 21-27 (2000).</li><li>Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+rol-6+gene,+which+interacts+with+the+sqt-1+collagen+gene+to+determine+organismal+morphology,+encodes+a+collagen.">The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen.</a> Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).</li><li>Thein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exoskeleton+collagen+COL-19:+an+adult-specific+marker+for+collagen+modification+and+assembly,+and+the+analysis+of+organismal+morphology.">Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology.</a> Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).</li><li>McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+sets+of+interacting+collagens+form+functionally+distinct+substructures+within+a+Caenorhabditis+elegans+extracellular+matrix.">Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).</li><li>Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+expression+of+male+copulatory+bursa+surface+markers+in+Caenorhabditis+elegans.">Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 103, 485-495 (1988).</li><li>Tong, Y. G., Burglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+for+dye-filling+of+sensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).</li><li>Singh, R. N., Sulston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans.">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li><li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+osm-6,+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148, 187-200 (1998).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

طريقة تلوين الجاذبة المقدمة هنا يسمح للطريقة سريعة ومريحة نسبيا لتصور في إهاب ايليجانس جيم. بواسطة repurposing وتحسين طريقة تستخدم عادة لصورة الخلايا العصبية الحسية 15،17 المعرضة بيئيا ، يمكن أن تستخدم لصبغ الجاذبة fluorescently كلا أجنحة وهياكل حلقية (الشكلان 1 و 2) ، ف...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكواشف </td><td> مرادفات </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> صلاح الغيدان </td><td> 1،1 &#39;- Dioctadecyl - 3 ، 3،3&#39; ، 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine بيركلورات </td><td> Biotium ، وشركة </td><td> 60010 </td><td> الأسهم التخفيف : 20 ملغ / مل في DMF تمييع العمل : 30 ملغ / مل </td></tr><tr><td> DMF </td><td> ثنائي ميثيل الفورماميد </td><td> سيغما الدريخ ، وشركة </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> تريتون نصف إله عند الإغريق X - 100 </td><td> Octylphenoxypolyethoxyethanol </td><td> VWR الدولية ، ذ. </td><td> EM - 9410 </td><td></td></tr><tr><td> M9 </td><td> 22mm و KH 2 PO 4 ، 42mM نا 2 هبو 4 ، 86mM كلوريد الصوديوم ، 1MM MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NGM &lt;/ TD&gt; <td> الخيطية النمو المتوسطة </td><td> المكافحة المتكاملة للآفات والعلم ، وشركة </td><td> 11006-501 </td><td> يمكن أن تكون مستعدة بعد بروتوكول آغار NGM 18 </td></tr><tr><td> أجار أجار </td><td></td><td> EMD كيماويات ، وشركة </td><td> 1،01614 </td><td> 4 ٪ في الماء </td></tr><tr><td> Levamisole </td><td> Levamisole هيدروكلوريد </td><td> سيغما الدريخ ، وشركة </td><td> 31742 </td><td> 100 ميكرون -- 1 ملي levamisole على النحو المطلوب </td></tr><tr><td> مجهر الشرائح </td><td></td><td> VWR الدولية ، ذ. </td><td> 16005-106 </td><td></td></tr><tr><td> النظارات المجهر تغطية </td><td></td><td> VWR الدولية ، ذ. </td><td> 16004-302 </td><td></td></tr><tr><td> مجمع نطاق </td><td></td><td> كارل زايس ، وشركة </td><td> A1m </td><td> استخدام الأهداف لتلبية احتياجات التجربة </td></tr><tr><td> متوافق تصفية TRITC أو غيرها </td><td> &amp;نبسب ؛ </td><td> صفاء شركة تكنولوجيا </td><td> 49005 </td><td> باءت بالفشل DSRed (TRITC/Cy3) تعيين مرشح -- ET </td></tr></tbody></table>

visualization of caenorhabditis elegans cuticular structures using the lipophilic vital dye dii

إهاب من C. ايليجانس هو بنية شديدة المقاومة التي تحيط الخارجي للحيوان 1-4. إهاب لا يحمي فقط من الحيوان والبيئة ، ولكن كما يحدد شكل الجسم ويلعب دورا في حراك 4-6. عدة طبقات يفرز من قبل خلايا البشرة تتكون من إهاب ، بما في ذلك طبقة الدهون الأبعد 7. دعا التلال كفافي في إهاب للحلقة نمط طول الحيوان وموجودة في جميع مراحل التنمية 8. أجنحة هي التلال الطولية التي موجودة خلال مراحل معينة من التنمية ، بما في ذلك L1 ، dauer ، ومراحل البالغين 2،9. يمكن أن الطفرات في الجينات التي تؤثر على المنظمة جليدية تغيير بنية الكولاجين جليدية والحيوان التشكل 5،6،10،11 الجسم. بينما التصوير المجهري باستخدام جليدية مجمع مدينة دبي للإنترنت مع البصريات هو ممكن ، الطرق الحالية التي تبرز هياكل جليدية تشمل fluores12 في المائة التحوير التعبير ، وتلطيخ الضد 13 ، والمجهر الإلكتروني 1. جرثومة القمح المسمى راصة (WGA) كما تم استخدامها لتصور جليكوبروتينات جليدية ، ولكن محدودة في حل هياكل جليدية الدقيقة 14. وقد لوحظ تلون سطح جليدية باستخدام صبغة الفلورسنت ، ولكن لم تتميز بالتفصيل 15. نقدم طريقة لتصور العيش في C. إهاب ايليجانس باستخدام صبغ أحمر فلوري محبة للدهون الجاذبة (1،1 &#39;- dioctadecyl - 3 ، 3،3&#39; ، 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine البركلورات) ، والذي يستخدم عادة في C. ايليجانس الخلايا العصبية لتصور المعرضة بيئيا. هذا البروتوكول الأمثل لتلطيخ الجاذبة هو بسيط ، طريقة قوية لرؤية ارتفاع القرار من الفلورسنت للحلقة ، جناح الكبير والفرج ، وذيل الذكور ، وارتفاع الذيل خنثى في C. ايليجانس.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI at JoVE.com

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

نقدم طريقة لتصور العيش في إهاب<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; باستخدام صبغ أحمر فلوري محبة للدهون الجاذبة (1،1 &#39;- dioctadecyl - 3 ، 3،3&#39; ، 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine البركلورات) ، والذي يستخدم عادة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; لتصور العصبونات المعرضة بيئيا. مع هذا البروتوكول الأمثل ، وجناح الكبير الملون والحلقي هياكل جليدية بواسطة الجاذبة ولاحظ باستخدام المجهر المركب.

تصور انواع معينة ايليجانس</emالهياكل البشرة> استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

visualization-caenorhabditis-elegans-cuticular-structures-using

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

17.0K Views.  Texas A&M University System Health Science Center, College of Medicine. نقدم طريقة لتصور العيش في إهاب C. ايليجانس باستخدام صبغ أحمر فلوري محبة للدهون الجاذبة (1،1 '- dioctadecyl - 3 ، 3،3' ، 3' - tetramethylindocarbocyanine البركلورات) ، والذي يستخدم عادة في C. ايليجانس لتصور العصبونات المعرضة بيئيا. مع هذا البروتوكول الأمثل ، وجناح الك?...

Video: Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

زراعة<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في ثلاثة أبعاد في المختبر

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

الجاذبة الإرواء كطريقة لتصور الأوعية الدموية في<em&gt; أمبيستوما ميكسيكانوم</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

المناهج الكمية لدراسة الهياكل الخلوية ومورفولوجيا الأعضاء في الكنورهابدية

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

استخدام Elegans Caenorhabditis إلى الشاشة لتفاعلات Chaperone الأنسجة محددة

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

استخراج على نطاق صغير من Caenorhabditis elegans الحمض النووي الجينومي

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

تصور انواع معينة ايليجانس استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان